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背景：
干细胞是指在一定条件下具有增殖和分化潜能的细胞，它具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。按其存在的不同时期，可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞是指一群分布在成体组织中尚未分化的，具有自我更新，构建和补充某种组织的各种类型细胞的潜能的干细胞，又称组织特异性干细胞。科学家已经在多种组织和器官内发现有成体干细胞的存在，如造血干细胞，神经干细胞，上皮干细胞等。目前，关于宫颈来源的干细胞的研究主要集中在宫颈储备细胞的研究。人的宫颈位于子宫下部，上端与子宫体相连，下端深入阴道。人宫颈由黏膜组织、肌组织和外膜组成。宫颈管黏膜即子宫颈内膜，由分泌黏液的单层柱状上皮覆盖。宫颈外口到阴道穹隆部分均由复层鳞状上皮覆盖。宫颈管柱状上皮与宫颈管外侧鳞状上皮的交界区称宫颈上皮移形带或转化区。在宫颈管内膜的柱状上皮下方、基底膜上方有储备细胞，具有增生，分化为柱状上皮细胞和化生为鳞状上皮细胞的双向分化潜能。研究表明，宫颈储备细胞的异常分化与宫颈疾病的发生有着密切的联系。
目的：
1.利用现有的干细胞培养体系，分别分离出鼠和人宫颈上皮干细胞。
2.利用现有的干细胞分化体系，探究宫颈上皮干细胞的分化潜能。
3.初步建立宫颈上皮微器官。
方法：
宫颈损伤模型：首先腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠，然后将注射器的针尖磨平，吸取125ul2.5%三氯乙酸(TCA)，注射器的针头经过阴道并伸入宫颈管内，推出三氯乙酸。5min后用PBS冲洗宫颈管内腔。分别在损伤后的第3天，第10天和第20天取出宫颈组织固定。
宫颈上皮干细胞的分离和鉴定：为分离鼠宫颈上皮干细胞，首先取出鼠宫颈组织，采用蛋白酶消化过夜的方法分离出鼠宫颈来源的细胞，将细胞铺在3T3饲养层细胞上，然后经胰蛋白酶梯度消化和反复传代，分离出鼠宫颈上皮干细胞。为分离人宫颈上皮干细胞，首先通过宫颈管修刮获得人宫颈上皮组织，采用蛋白酶消化的方法分离出人宫颈来源的细胞，将细胞铺在3T3饲养层细胞上，分离出人宫颈上皮干细胞。利用免疫荧光染色技术对两种干细胞进行鉴定并分别统计两种干细胞的克隆形成率，对于传代后期的人宫颈上皮干细胞进行核型鉴定。
干细胞的分化：对于鼠宫颈来源的上皮干细胞采用三维基质胶培养(3D Matrigel Culture)体外分化系统进行分化，对于人宫颈上皮干细胞采用三维基质胶培养体外分化系统，气-液界面培养(Air-Liquid Interface Culture)体外分化系统和肾包膜皮下注射体内分化系统进行分化。对分化后行成的宫颈上皮微器官进行染色鉴定和功能实验。
结果：
1.正常鼠子宫颈组织免疫荧光染色结果：细胞角蛋白5和14(CK5, CK14)表达于所有宫颈上皮中；细胞角蛋白13(CK13)表达于宫颈内侧和宫颈外侧的基底上层细胞中；细胞角蛋白10(CK10)宫颈内侧几乎不表达，它只在宫颈口和宫颈外侧的基底上层细胞中被检测到；肿瘤蛋白63(p63)表达于宫颈上皮的基底层和亚基底层，其中基底层的表达要强于亚基底层。
2.小鼠宫颈损伤模型：小鼠宫颈内膜在损伤后发生鳞状上皮化生。
3.小鼠宫颈上皮干细胞的鉴定:培养皿中的细胞克隆表达肿瘤蛋白63，细胞角蛋白5(p63, CK5)这两个干细胞的标志物，但不表达细胞角蛋白10，13和黏蛋白1(CK10,CK13和MUC1)这些分化的标志物。
4.人宫颈上皮干细胞的鉴定：细胞克隆是人特异的核纤层蛋白A/C(LAMINA+C)阳性的。细胞克隆表达上皮的标志物上皮型钙黏附蛋白(E-Cadherin)，表达增殖的标志物KI67，表达干细胞的标志物肿瘤蛋白63，细胞角蛋白5和14(P63, CK5, CK14)，不表达分化的标志物细胞角蛋白10，13和外皮蛋白(CK10,CK13和IVL)。它们也表达细胞角蛋白7和18(CK7，CK18)，但不表达黏蛋白5AC和孕激素相关子宫内膜蛋白(MUC5AC, PAEP)这两个宫颈内侧上皮的标志物。少数克隆里的部分细胞表达黏蛋白1和2(MUC1，MUC2)。传代后期的人宫颈干细胞核型是正常的。
5.鼠和人宫颈上皮干细胞的克隆形成率分别稳定在60%和30%左右。
6.体外分化：由鼠宫颈上皮干细胞分化形成实心球体样的类器官，类器官的最外层是肿瘤蛋白63阳性(p63+)的细胞，它们同时表达细胞角蛋白5(CK5)，但不表达细胞角蛋白10和13(CK10，CK13)，类器官里面是肿瘤蛋白63阴性(p63-)的细胞，表达细胞角蛋白13(CK13)，其中部分细胞表达细胞角蛋白10(CK10)，部分表达黏蛋白1(Muc1)。由人宫颈上皮干细胞分化形成空心球体样的类器官，类器官不表达肿瘤蛋白63(P63)，但表达外皮蛋白，细胞角蛋白10和13，黏蛋白1(IVL,CK10,CK13和MUC1),其中表达细胞角蛋白10(CK10)的细胞非常稀少。细胞球不表达人宫颈内侧上皮的标志物黏蛋白2，黏蛋白5AC和孕激素相关子宫内膜蛋白(MUC2,MUC5AC和PAEP)。
7.人宫颈上皮干细胞的体内分化：根据苏木精&伊红(H&E)染色结果，人宫颈干细胞在体内分化成类似于未成熟的复层鳞状上皮结构。根据免疫荧光染色结果，依附在肾包膜上的细胞表达肿瘤蛋白63(P63)，但不表达细胞角蛋白10，13和外皮蛋白(CK10,CK13和IVL)，类似于复层上皮的基底层。基底上层的肿瘤蛋白63阴性(p63-)的细胞表达细胞角蛋白10，13和外皮蛋白(CK10,CK13和IVL)鳞状上皮的标志物，其中部分细胞表达黏蛋白1(MUC1)。所有分化组织还表达细胞角蛋白5，8和18(CK5,CK8和CK18)，但它们不表达黏蛋白1，黏蛋白5AC，孕激素相关子宫内膜蛋白和细胞角蛋白7(MUC2,MUC5AC，PAEP和CK7)，并且仅有一小部分表达细胞角蛋白14(CK14)。
8.功能实验：利用气-液界面培养(Air-Liquid Interface Culture)方法，人宫颈干细胞在体外分化成宫颈上皮微器官。经鉴定，表达细胞角蛋白10，13和外皮蛋白(CK10,CK13和IVL)这些鳞状上皮的标志物，同时在上皮组织的表层检测到了分泌蛋白黏蛋白1(MUC1)。RNA测序结果表明分化后的组织呈现出免疫防御的趋势。
结论：
1.宫颈上皮干细胞源于宫颈上皮的基底层。
2.鼠宫颈上皮干细胞具有分化成宫颈内侧和宫颈外侧上皮的分化潜能。
3.人宫颈上皮干细胞更倾向于分化成宫颈外侧复层鳞状上皮组织，类似于宫颈的转化区。
4.初步建立起由人宫颈干细胞分化形成的宫颈上皮微器官模型。
干细胞是指在一定条件下具有增殖和分化潜能的细胞，它具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。按其存在的不同时期，可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞是指一群分布在成体组织中尚未分化的，具有自我更新，构建和补充某种组织的各种类型细胞的潜能的干细胞，又称组织特异性干细胞。科学家已经在多种组织和器官内发现有成体干细胞的存在，如造血干细胞，神经干细胞，上皮干细胞等。目前，关于宫颈来源的干细胞的研究主要集中在宫颈储备细胞的研究。人的宫颈位于子宫下部，上端与子宫体相连，下端深入阴道。人宫颈由黏膜组织、肌组织和外膜组成。宫颈管黏膜即子宫颈内膜，由分泌黏液的单层柱状上皮覆盖。宫颈外口到阴道穹隆部分均由复层鳞状上皮覆盖。宫颈管柱状上皮与宫颈管外侧鳞状上皮的交界区称宫颈上皮移形带或转化区。在宫颈管内膜的柱状上皮下方、基底膜上方有储备细胞，具有增生，分化为柱状上皮细胞和化生为鳞状上皮细胞的双向分化潜能。研究表明，宫颈储备细胞的异常分化与宫颈疾病的发生有着密切的联系。
目的：
1.利用现有的干细胞培养体系，分别分离出鼠和人宫颈上皮干细胞。
2.利用现有的干细胞分化体系，探究宫颈上皮干细胞的分化潜能。
3.初步建立宫颈上皮微器官。
方法：
宫颈损伤模型：首先腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠，然后将注射器的针尖磨平，吸取125ul2.5%三氯乙酸(TCA)，注射器的针头经过阴道并伸入宫颈管内，推出三氯乙酸。5min后用PBS冲洗宫颈管内腔。分别在损伤后的第3天，第10天和第20天取出宫颈组织固定。
宫颈上皮干细胞的分离和鉴定：为分离鼠宫颈上皮干细胞，首先取出鼠宫颈组织，采用蛋白酶消化过夜的方法分离出鼠宫颈来源的细胞，将细胞铺在3T3饲养层细胞上，然后经胰蛋白酶梯度消化和反复传代，分离出鼠宫颈上皮干细胞。为分离人宫颈上皮干细胞，首先通过宫颈管修刮获得人宫颈上皮组织，采用蛋白酶消化的方法分离出人宫颈来源的细胞，将细胞铺在3T3饲养层细胞上，分离出人宫颈上皮干细胞。利用免疫荧光染色技术对两种干细胞进行鉴定并分别统计两种干细胞的克隆形成率，对于传代后期的人宫颈上皮干细胞进行核型鉴定。
干细胞的分化：对于鼠宫颈来源的上皮干细胞采用三维基质胶培养(3D Matrigel Culture)体外分化系统进行分化，对于人宫颈上皮干细胞采用三维基质胶培养体外分化系统，气-液界面培养(Air-Liquid Interface Culture)体外分化系统和肾包膜皮下注射体内分化系统进行分化。对分化后行成的宫颈上皮微器官进行染色鉴定和功能实验。
结果：
1.正常鼠子宫颈组织免疫荧光染色结果：细胞角蛋白5和14(CK5, CK14)表达于所有宫颈上皮中；细胞角蛋白13(CK13)表达于宫颈内侧和宫颈外侧的基底上层细胞中；细胞角蛋白10(CK10)宫颈内侧几乎不表达，它只在宫颈口和宫颈外侧的基底上层细胞中被检测到；肿瘤蛋白63(p63)表达于宫颈上皮的基底层和亚基底层，其中基底层的表达要强于亚基底层。
2.小鼠宫颈损伤模型：小鼠宫颈内膜在损伤后发生鳞状上皮化生。
3.小鼠宫颈上皮干细胞的鉴定:培养皿中的细胞克隆表达肿瘤蛋白63，细胞角蛋白5(p63, CK5)这两个干细胞的标志物，但不表达细胞角蛋白10，13和黏蛋白1(CK10,CK13和MUC1)这些分化的标志物。
4.人宫颈上皮干细胞的鉴定：细胞克隆是人特异的核纤层蛋白A/C(LAMINA+C)阳性的。细胞克隆表达上皮的标志物上皮型钙黏附蛋白(E-Cadherin)，表达增殖的标志物KI67，表达干细胞的标志物肿瘤蛋白63，细胞角蛋白5和14(P63, CK5, CK14)，不表达分化的标志物细胞角蛋白10，13和外皮蛋白(CK10,CK13和IVL)。它们也表达细胞角蛋白7和18(CK7，CK18)，但不表达黏蛋白5AC和孕激素相关子宫内膜蛋白(MUC5AC, PAEP)这两个宫颈内侧上皮的标志物。少数克隆里的部分细胞表达黏蛋白1和2(MUC1，MUC2)。传代后期的人宫颈干细胞核型是正常的。
5.鼠和人宫颈上皮干细胞的克隆形成率分别稳定在60%和30%左右。
6.体外分化：由鼠宫颈上皮干细胞分化形成实心球体样的类器官，类器官的最外层是肿瘤蛋白63阳性(p63+)的细胞，它们同时表达细胞角蛋白5(CK5)，但不表达细胞角蛋白10和13(CK10，CK13)，类器官里面是肿瘤蛋白63阴性(p63-)的细胞，表达细胞角蛋白13(CK13)，其中部分细胞表达细胞角蛋白10(CK10)，部分表达黏蛋白1(Muc1)。由人宫颈上皮干细胞分化形成空心球体样的类器官，类器官不表达肿瘤蛋白63(P63)，但表达外皮蛋白，细胞角蛋白10和13，黏蛋白1(IVL,CK10,CK13和MUC1),其中表达细胞角蛋白10(CK10)的细胞非常稀少。细胞球不表达人宫颈内侧上皮的标志物黏蛋白2，黏蛋白5AC和孕激素相关子宫内膜蛋白(MUC2,MUC5AC和PAEP)。
7.人宫颈上皮干细胞的体内分化：根据苏木精&伊红(H&E)染色结果，人宫颈干细胞在体内分化成类似于未成熟的复层鳞状上皮结构。根据免疫荧光染色结果，依附在肾包膜上的细胞表达肿瘤蛋白63(P63)，但不表达细胞角蛋白10，13和外皮蛋白(CK10,CK13和IVL)，类似于复层上皮的基底层。基底上层的肿瘤蛋白63阴性(p63-)的细胞表达细胞角蛋白10，13和外皮蛋白(CK10,CK13和IVL)鳞状上皮的标志物，其中部分细胞表达黏蛋白1(MUC1)。所有分化组织还表达细胞角蛋白5，8和18(CK5,CK8和CK18)，但它们不表达黏蛋白1，黏蛋白5AC，孕激素相关子宫内膜蛋白和细胞角蛋白7(MUC2,MUC5AC，PAEP和CK7)，并且仅有一小部分表达细胞角蛋白14(CK14)。
8.功能实验：利用气-液界面培养(Air-Liquid Interface Culture)方法，人宫颈干细胞在体外分化成宫颈上皮微器官。经鉴定，表达细胞角蛋白10，13和外皮蛋白(CK10,CK13和IVL)这些鳞状上皮的标志物，同时在上皮组织的表层检测到了分泌蛋白黏蛋白1(MUC1)。RNA测序结果表明分化后的组织呈现出免疫防御的趋势。
结论：
1.宫颈上皮干细胞源于宫颈上皮的基底层。
2.鼠宫颈上皮干细胞具有分化成宫颈内侧和宫颈外侧上皮的分化潜能。
3.人宫颈上皮干细胞更倾向于分化成宫颈外侧复层鳞状上皮组织，类似于宫颈的转化区。
4.初步建立起由人宫颈干细胞分化形成的宫颈上皮微器官模型。