第一部分ASP受体在前脂肪细胞分化过程中的时序性表达研究目的阐明促酰化蛋白（Acylationg Stimulating Protein, ASP）受体在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中表达的时序性规律。方法1.采用激素“鸡尾酒”（10μg/ml胰岛素+0.5 mmol/L 1-甲基3-异丁基黄嘌呤+1.0μmol/L地塞米松）诱导方法,诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为脂肪细胞,光学显微镜观察3T3-L1前脂肪细胞的形态学变化,即细胞内脂滴的形成,油红O染色观察胞浆中脂滴的聚集。2.荧光显微镜观察ASP受体C5L2在细胞膜定位、分布规律。3.采用RT-PCR方法,检测C5L2在前脂肪细胞分化不同阶段mRNA表达。4.采用流式细胞仪检测C5L2在前脂肪细胞分化不同阶段蛋白表达。结果1. 3T3-L1前脂肪细胞表现为成纤维细胞样长梭形,胞浆中无脂滴;分化成熟后,细胞变大、变圆,胞浆可见明显的脂滴,呈“戒环”状。2. C5L2主要表达于细胞膜,前脂肪细胞和成熟脂肪细胞有中度表达,分化早期表达较强。3.在诱导分化0d, C5L2 mRNA有低水平的表达,诱导分化1d C5L2 mRNA表达明显增加（p<0.05）,诱导分化3d,6d和9d C5L2 mRNA水平分别是0d的2.08倍、2.44倍和3.56倍（p<0.05或p<0.01）。4.在诱导分化0d,C5L2蛋白阳性表达率为（50.71±14.58）%,诱导分化6h C5L2蛋白表达增加了21% （p<0.05）;分化12h达高峰,增加了38%（p<0.01）;分化1d增加了11%（p<0.05）,并逐渐减少;分化3d基本恢复至0d水平,分化6d和9d C5L2表达与0d无显著性差异（p>0.05）。结论ASP受体在前脂肪细胞分化过程中的发生、发育、定位具有时序性和空间分布规律。3T3-L1前脂肪细胞C5L2 mRNA表达呈分化依赖性增加,而C5L2蛋白表达水平在分化早期显著增强。ASP-C5L2途径参与了脂肪细胞分化的调控过程,对于C5L2在翻译水平的变化机制尚有待深入探索。第二部分ASP-受体C5L2途径在脂肪酸诱导的（前）脂肪细胞胰岛素抵抗中的作用研究目的1.观察不同浓度单不饱和脂肪酸（油酸）和饱和脂肪酸（棕榈酸）对3T3-L1(前脂肪细胞葡萄糖转运的影响,探讨高游离脂肪酸（Free Fatty Acid,FFA）负荷在胰岛素抵抗和ASP抵抗形成中的意义,以期阐明高FFA负荷诱导的胰岛素抵抗状态下同时存在ASP抵抗。2.探讨FFA诱导的3T3-L1（前）脂肪细胞ASP抵抗的机制。观察FFA对3T3-L1（前）脂肪细胞ASP受体C5L2-mRNA和细胞表面C5L2蛋白表达的影响,以期从受体水平探讨ASP抵抗的机制;观察ASP刺激后3T3-L1（前）脂肪细胞Gβ,Gαq/11,磷酸化蛋白激酶Cα（p-PKCα）和磷酸化蛋白激酶Cζ（p-PKCζ）蛋白表达规律,阐明G蛋白和PKC途径与ASP-C5L2的关系;观察FFA对3T3-L1（前）脂肪细胞Gβ,Gαq/11,p-PKCα和p-PKCζ蛋白以及ASP刺激的Gβ,Gαq/11,p-PKCα和p-PKCζ蛋白表达的影响,以期从受体后信号分子水平探讨ASP抵抗的机制。方法1.采用2-脱氧-[3H]-D-葡萄糖掺入法,观察3T3-L1前脂肪细胞最大葡萄糖摄取率时最佳胰岛素作用浓度和时间;在此基础上检测不同浓度（0mmol/L～1.0mmol/L）油酸、棕榈酸孵育过夜后3T3-L1成熟脂肪细胞和前脂肪细胞基础状态、胰岛素刺激状态和ASP刺激状态的葡萄糖摄取率。2.分别采用RT-PCR和流式细胞仪检测FFA孵育过夜3T3-L1成熟脂肪细胞和前脂肪细胞C5L2 mRNA和蛋白表达。3. 3T3-L1成熟脂肪细胞和前脂肪细胞分别给予0μmol/L和5.0μmol/L ASP刺激4h后,采用Western Blot法检测Gβ,Gαq/11,p-PKCα和p-PKCζ蛋白表达。4. 3T3-L1成熟脂肪细胞和前脂肪细胞给予FFA孵育过夜后,采用Western Blot法检测基础状态和ASP刺激的Gβ,Gαq/11,p-PKCα和p-PKCζ蛋白表达。结果1. 100 nmol/L胰岛素刺激15min时葡萄糖转运率显著增加（P<0.05）;1h时达高峰（P<0.01）;6h恢复至基础状态水平（P>0.05）。50 nmol/L胰岛素作用1h,3T3-L1前脂肪细胞葡萄糖转运率增加了336%（P<0.01）;100 nmol/L时达最高峰,葡萄糖转运率增加了394%（P<0.01）,并逐渐趋于稳态。可见,100 nmol/L胰岛素作用1h细胞葡萄糖转运率最强,根据此研究结果,选择100 nmol/L胰岛素作用1h以判断FFA对胰岛素激发的葡萄糖转运率的影响。2. 0.125 mmol/L～1.0 mmol/L油酸和棕榈酸不影响3T3-L1成熟脂肪细胞基础状态的葡萄糖转运,但呈浓度依赖性抑制细胞胰岛素刺激的葡萄糖转运。油酸组葡萄糖摄取率分别减少4%（p>0.05）、36%（ p<0.05）和48% （p<0.05）;棕榈酸组葡萄糖摄取率分别减少11%（p>0.05）、18%（ p>0.05）和43% （p<0.05）。在3T3-L1前脂肪细胞,油酸和棕榈酸同样不影响前脂肪细胞基础状态的葡萄糖转运,对胰岛素刺激的葡萄糖转运,油酸组分别减少22%、29%和49%（p<0.05或p<0.01）;棕榈酸组葡萄糖摄取率分别减少42%、49%和65%（p<0.05或p<0.01）。3. ASP刺激后,3T3-L1成熟脂肪细胞和前脂肪细胞葡萄糖摄取率明显增加,分别是基础状态的1.98倍(（p<0.01）和2.87倍(（p<0.01）,表明ASP具有促进脂肪细胞葡萄糖转运的能力。低浓度FFA不影响ASP刺激的葡萄糖转运;随着FFA浓度增加,ASP刺激的葡萄糖转运明显下调。1.0 mmol/L时油酸组和棕榈酸组ASP刺激的成熟脂肪细胞葡萄糖摄取率分别减少47% （p<0.01）和34% （p<0.05）,前脂肪细胞葡萄糖摄取率分别减少43% （p<0.01）和62% （p<0.01）。4.高浓度FFA能显著性抑制3T3-L1成熟脂肪细胞C5L2-mRNA和蛋白表达。1.0 mmol/L时,油酸组成熟脂肪细胞C5L2-mRNA和细胞表面C5L2蛋白表达分别下降了84%（p<0.05）和39%（p<0.01）;棕榈酸组最大抑制率分别为41%（p<0.05）和55%（p<0.01）。但前脂肪细胞C5L2-mRNA和蛋白表达水平均无显著性差异（p>0.05）。5. ASP显著增强特异性Gβ,Gαq/11, p-PKCα和p-PKCζ蛋白表达。ASP刺激后, 3T3-L1成熟脂肪细胞Gβ,Gαq/11,p-PKCα和p-PKCζ蛋白表达分别增加了26%,32%,71%和49%（p<0.05或p<0.01）;前脂肪细胞Gβ,Gαq/11,p-PKCα和p-PKCζ蛋白表达分别增加了34%,27%,40%和57%（p<0.05或p<0.01）。6. 1.0 mmol/L油酸和棕榈酸抑制成熟脂肪细胞基础状态和ASP刺激的Gβ,Gαq/11,p-PKCα和p-PKCζ蛋白表达,油酸组ASP刺激的蛋白表达分别减少了47%Gβ,44%Gαq/11,39%p-PKCα（p<0.05或p<0.01）和20%p-PKCζ（p>0.05）;棕榈酸组ASP刺激的蛋白表达分别减少了50%Gβ,43%Gαq/11,44%p-PKCα和43%p-PKCζ（p<0.05或p<0.01）。在前脂肪细胞,油酸分别抑制ASP刺激的23%Gβ（p>0.05）,4%Gαq/11（p>0.05）,39%p-PKCα（p<0.05）和19%p-PKCζ（p<0.05）蛋白表达;棕榈酸组ASP刺激的蛋白表达分别减少了45%Gβ,50%Gαq/11,52%p-PKCα和21%p-PKCζ（p<0.05或p<0.01）。结论1.油酸或棕榈酸抑制3T3-L1成熟脂肪细胞和前脂肪细胞胰岛素刺激和ASP刺激的葡萄糖转运,首次证明FFA诱导脂肪细胞产生胰岛素抵抗状态下同时存在ASP抵抗。2. ASP-C5L2通过激活Gβ,Gαq/11, PKCα和PKCζ信号分子发挥调控脂肪细胞分化及葡萄糖转运等生物学作用。3. FFA诱导的ASP抵抗的发生机制与下调脂肪细胞表面ASP受体功能有关,与干扰ASP-C5L2信号转导途径有关。ASP抵抗参与了“脂毒性”-胰岛素抵抗/肥胖症的病理生理过程。第三部分ASP-受体C5L2途径在性激素诱导的（前）脂肪细胞胰岛素抵抗中的作用研究目的1.观察不同浓度17β-雌二醇、睾酮和孕酮对3T3-L1（前）脂肪细胞葡萄糖转运的影响,探讨高性激素负荷在胰岛素抵抗和ASP抵抗形成中的意义,以期阐明高性激素负荷诱导的胰岛素抵抗状态下同时存在ASP抵抗。2.探讨性激素诱导的3T3-L1（前）脂肪细胞ASP抵抗的机制。观察性激素对3T3-L1（前）脂肪细胞ASP受体C5L2-mRNA和细胞表面C5L2蛋白表达的影响,以期从受体水平探讨ASP抵抗的机制;观察性激素对3T3-L1（前）脂肪细胞Gβ,Gαq/11,p-PKCα和p-PKCζ蛋白以及ASP刺激的Gβ,Gαq/11,p-PKCα和p-PKCζ蛋白表达的影响,以期从受体后信号分子水平探讨ASP抵抗的机制。方法1.采用2-脱氧-[3H]-D-葡萄糖掺入法,检测不同浓度(10^-8 mol/L～10^-6 mol/L)17β-雌二醇、睾酮和孕酮孵育过夜后3T3-L1成熟脂肪细胞和前脂肪细胞基础状态、胰岛素刺激状态和ASP刺激状态的葡萄糖摄取率。2.分别采用RT-PCR和流式细胞仪检测性激素孵育过夜3T3-L1成熟脂肪细胞和前脂肪细胞C5L2 mRNA和蛋白表达。3. 3T3-L1成熟脂肪细胞和前脂肪细胞给予性激素孵育过夜后,采用Western Blot法检测基础状态和ASP刺激的Gβ,Gαq/11,p-PKCα和p-PKCζ蛋白表达。结果1. 10^-8 mol/L～10^-6 mol/L 17β-雌二醇、睾酮和孕酮不影响3T3-L1成熟脂肪细胞和前脂肪细胞基础状态的葡萄糖转运。胰岛素刺激后,10^-6 mol/L 17β-雌二醇和睾酮分别显著性抑制39% （p<0.05）和42% （p<0.01）成熟脂肪细胞葡萄糖转运,而孕酮对成熟脂肪细胞葡萄糖转运无明显抑制作用;在前脂肪细胞,10^-8 mol/L和/或10^-7 mol/L 17β-雌二醇和睾酮能轻度增加胰岛素刺激的葡萄糖转运,高浓度时(10^-6 mol/L)分别抑制32% （p<0.05）和40% （p<0.05）前脂肪细胞葡萄糖转运;孕酮呈浓度依赖性抑制前脂肪细胞胰岛素刺激的葡萄糖转运,最大抑制率为38% （p<0.01）。2. ASP刺激状态,10^-8 mol/L～10^-7 mol/L 17β-雌二醇和睾酮对3T3-L1成熟脂肪细胞葡萄糖转运无显著性差异（p均>0.05）,10^-6 mol/L时分别抑制46% （p<0.01）和46% （p<0.01）成熟脂肪细胞葡萄糖摄取率,10^-7 mol/L和10^-6 mol/L孕酮分别抑制55%（ p<0.01）和52% （p<0.01）成熟脂肪细胞葡萄糖摄取率。在前脂肪细胞,高浓度(10^-6 mol/L)性激素均显著抑制ASP刺激的葡萄糖转运（ p均<0.05）。3. 10^-8 mol/L 17β-雌二醇轻度增加3T3-L1成熟脂肪细胞和前脂肪细胞C5L2-mRNA和蛋白的表达, 10^-6 mol/L时3T3-L1成熟脂肪细胞C5L2-mRNA和蛋白表达分别下降了40% （p<0.05）和21%（p<0.05）。睾酮呈浓度依赖性均抑制3T3-L1成熟脂肪细胞C5L2-mRNA和蛋白的表达,10^-6 mol/L时mRNA和蛋白分别减少了60% （p<0.01）和27%（p<0.01）。但前脂肪细胞C5L2-mRNA和蛋白表达水平均无显著性差异（p均>0.05）。孕酮最大抑制成熟脂肪细胞14% （p>0.05） C5L2-mRNA和22%（p<0.01）蛋白表达,与17β-雌二醇和睾酮不同,高浓度的孕酮能显著性抑制前脂肪细胞66% （p<0.01） C5L2-mRNA和29%（p<0.05） C5L2蛋白表达。4.高浓度(10^-6 mol/L)性激素在一定程度上抑制ASP刺激的成熟脂肪细胞Gβ,Gαq/11,p-PKCα和p-PKCζ的表达,17β-雌二醇组ASP刺激的蛋白表达分别减少了23%,17%,15%和15%（p均>0.05）;睾酮组分别减少了27%（p>0.05）,52%（p<0.05）,50%（p<0.01）和57%（p<0.05）;孕酮组分别减少了63%（p<0.05）,41%（p<0.05）,49%（p<0.01）和32%（p>0.05）。在前脂肪细胞,10^-6 mol/L 17β-雌二醇显著性抑制24%（p<0.05）ASP刺激的Gαq/11蛋白表达,睾酮对前脂肪细胞ASP-C5L2下游信号分子Gβ,Gαq/11,p-PKCα和p-PKCζ表达无明显抑制作用;高浓度孕酮显著性抑制ASP刺激的43%Gβ（p<0.05）,59%Gαq/11（p<0.01）,51%p-PKCα（p<0.05）和30%p-PKCζ（p<0.05）的表达。结论1.性激素抑制3T3-L1成熟脂肪细胞和前脂肪细胞胰岛素刺激和ASP刺激的葡萄糖转运,提示在性激素诱导脂肪细胞产生胰岛素抵抗状态下同时存在ASP抵抗。2.性激素诱导的ASP抵抗的发生机制与下调脂肪细胞表面ASP受体功能有关,与干扰ASP-C5L2信号转导途径有关。ASP抵抗参与了高雌二醇、睾酮和孕酮引起的胰岛素抵抗状态的病理生理过程,ASP抵抗可能参与妊娠糖尿病、多囊卵巢综合征（PCOS）、肥胖症等多种疾病的病理生理过程。