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猪流行性感冒(swine influenza,SI),简称猪流感,由A型流感病毒(swine influenza virus,SIV)引起的一种是猪的急性、高度传染性呼吸系统疾病。其临床特征为突发,咳嗽,呼吸困难、食欲减退、发热及怀孕母猪流产等,发病率高,死亡率低,但是感染猪以后导致其产量下降,给养猪业带来严重的经济损失,同时也给人类公共卫生带来潜在的威胁。先天性免疫应答是机体防御病原微生物的第一道防线,对不同病原病原微生物的入侵做出做出不同的反应,激活特定的信号通路并且具有非常严格的调控机制。目前已知机体内有Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)和RIG-Ⅰ 样受体(RIG-Ⅰ-like receptor,RLR)两条信号通路,两者介导的中间信号传递分子有所不同,前者主要是TRIF和MyD88,后者主要是MAVS,在信号传递的下游,这两条途径有汇于一处,激活一系列磷酸激酶,从而活化IRF-3和NF-κB,活化的IRF-3和NF-kB进入细胞核启动IFN-β的表达,完成固有免疫应答的启动。了解猪流感病毒感染宿主后,宿主是如何抑制病毒复制而发挥抗病毒先天性免疫应答具有重要的意义。本实验通过筛选出比较合适的细胞系研究猪流感病毒感染细胞后,通过过表达MAVS后,猪流感病毒感染细胞检测先天免疫系统相关受体、重要接头蛋白及效应分子在mRNA水平上的表达,进而研究MAVS蛋白在抗SIV H3N2亚型时的抗病毒作用。实验Ⅰ病毒感染对三种宿主细胞天然免疫信号通路的影响本实验通过用流感病毒H3N2亚型感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、传代鸡胚成纤维细胞(DF1)和人肺上皮细胞(A549细胞),检测在MOI=1时,流感病毒在三种细胞上的增殖,并检测感染病毒达到峰值时先天性免疫系统相关受体(TLR3/7、RIG-Ⅰ/MDA5)、重要接头蛋白(MAVS、MyD88、IRF3/7)在mRNA水平上的表达情况。结果发现,Vero细胞和A549细胞对流感病毒H3N2亚型毒株比较敏感,病毒滴度在16h时均达到峰值,而且病毒的效价也比较高,但是由于Vero细胞是干扰素缺陷细胞,在先天性免疫应答中相关受体和重要接头蛋白在感染病毒和对照细胞之间没有显著差异,除了TLR7和MDA5;A549细胞中相关受体和重要接头蛋白及效应分子在接毒组和空白组表达差异显著。其而DF1细胞对猪流感病毒N3N2亚型毒株不敏感,病毒滴度在6h时达到峰值,但是病毒效价相比Vero细胞和A549细胞要降低100倍左右。实验Ⅱ MAVS基因真核表达载体的构建与表达为了构建线粒体抗病毒蛋白MAVS基因的真核表达载体,本研究设计带flag标签的MAVS引物,用于扩增目的蛋白MAVS的基因,连接pMD19-T载体进行序列分析,将正确的序列连接真核表达载体pEF4/V5-His A,B,C,构建MAVS的真核表达载体pEF-MAVS,并通过双酶切实验进行鉴定,得到符合目的基因大小的条带,并通过Western-blotting检测目的基因真核表达载体在A549细胞中的表达情况,结果显示有符合目的蛋白大小的特异性条带存在。实验Ⅲ线粒体蛋白MAVS抗猪流感病毒的初步研究线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)作为一种接头蛋白在调节宿主天然免疫信号通路过程中扮演重要角色。本研究拟过表达MAVS到A549细胞后,通过SIV H3N2亚型刺激细胞,采用实时荧光定量PCR法分析TLR和RIG-I/MDA5两条抗病毒信号通路上重要受体、衔接蛋白及效应分子在mRNA水平上表达的变化,结果发现,MAVS能够促进下游因子的表达,进一步提高机体抵抗病毒的感染。Western-blot检测MAVS在蛋白水平的变化,发现MAVS在感染病毒以后发生降解,具体的机制还需进一步的研究。