氧化锌纳米粒子(ZnO NPs)因其优越的理化性能,在生物医学、日用化妆品、电子、环境等领域备受青睐。但随着人们对ZnO NPs认识的不断深入,各项研究证实,直接或间接接触ZnO NPs将对生物体有负面影响。Ca2+是一种维持细胞正常生理功能、调控细胞生理活动的重要离子,研究ZnO NPs对细胞内Ca2+代谢的有助于准确评价ZnO NPs的生物安全性。本文主要用钙离子选择性微电极对经ZnO NPs处理的芦荟细胞原生质体进行测量。实验在低钙、低渗测试液中进行,对原生质体破裂过程Ca2+的释放过程及ZnO NPs与细胞膜损伤的关系进行研究。采用新鲜的芦荟叶片通过酶解的方法制备原生质体,优化了原生质体的制备过程,提高了相应的产率和产量。实验用ZnO NPs购自sigma公司,粒径<50 nm,通过超声分散至无钙培养基中制成120 mh/L的悬液。直径0.1mm的硼硅酸盐玻璃毛坯管经拉制成为尖端直径2-3μm的玻璃微电极,后经硅烷化、灌充电解液、吸入钙离子交换剂(LIX)、插入内参比电极制成钙离子选择性微电极。电极的转化效率高于90%,检测下限为10-6 mol/L,响应时间t95%＞1 s,稳定性和重复性良好。将活性良好的芦荟原生质体分成两等份,一份作为对照组,另一份作为实验组。实验组的培养基含有120 mg/L的ZnO NPs,对照组不含ZnO NPs。两组原生质体在相同条件下培养10 h。将培养后的原生质体分别转移到无钙低渗液中,用钙离子选择性微电极在细胞外0.3 mm处进行电位实时测量,电位值与钙离子浓度间关系由能斯特方程给出。实验发现,原生质体破裂死亡前细胞外Ca2+浓度较为稳定,在原生质体破裂瞬间Ca2+浓度迅速升高,达到峰值后缓缓下降,最后和背景Ca2+浓度趋于一致,钙离子浓度随时间变化的曲线为一倒钟形脉冲。对原生质体死亡过程中ca2+浓度脉冲的前沿时间进行统计分析发现,对照组前沿时间符合生物统计中的正态分布,均值为9.74 s,前沿时间较短。而实验组在ZnO NPs胁迫下,其前沿时间的统计分布发生很大变化,前沿时间主要集中在11.97s左右。造成这种现象原因可能是ZnO NPs的胁迫改变了细胞膜的性质。分析原生质体死亡过程中Ca2+浓度脉冲信号的峰值,实验组和对照组电位峰值均符合正态分布,显著性为0.413。实验组峰值电位为-6.59 mv,对照组峰值电位为-6.30 mv,换算成钙离子浓度约为10-2 mol/L量级。查阅资料,芦荟细胞质内正常的钙离子浓度约为10-6mol/L水平。由于原生质体是在低钙环境中培养、测量,细胞从周围环境中摄取大量钙离子的可能性较小,因此原生质体死亡前,其内部的钙库可能释放了大量的钙离子。综上所述,本文采用离子选择性微电极技术,用从新的角度研究ZnO NPs对细胞的生理毒性,给纳米毒理学的研究提供了新的切入点。