心血管疾病是目前世界上发病率和死亡率最高的疾病,应激作为心血管疾病的重要病因和诱因已得到确认,甚至有学者认为心血管疾病是第一应激性疾病。冠心病、病毒性心肌炎、心肌病、高血压、心力衰竭等心血管疾病伴发的心律失常发病率最高,也是这些疾病的最终死因之一。在每年约 100 万心脏病死亡者中有一半是突发的,可在症状发作后数分钟至数 h 死亡,世界卫生组织将其定义为心脏性猝死。猝死的原因常见由心肌缺血引起心室颤动所致,Lown 等将此种突发性心律失常命名为“电意外”,并认为交感张力增加在发病中起关键性作用。近年来越来越多的实验和流行病学研究提示情绪障碍、行为类型和心理应激在心脏性猝死的发生中起了重要作用。有人通过对 200 例心律失常患者发病原因的统计,总结出有 95%心律失常的发生与应激有直接关系。 国外对应激诱发心律失常的研究较深入,表明应激诱发的心律失常与心肌细胞膜APD,Na+-K+-ATP 酶,钠、钾及钙离子通道电流,肾上腺素能受体的密度,心肌细胞内钠、钾及钙离子浓度,心肌电稳定性等的改变有关,上述变化可造成心脏形态学可见的小灶性损伤,大范围的可见到心肌的过度伸展(应激后僵化,post-stress rigidity)。目前认为应激诱发心律失常的机理是:机体在应激状态下产生一系列生理心理反应,使神经内分泌系统活动增强,导致一方面交感-肾上腺髓系统活动增强,使体内肾上腺素、去甲肾上腺素释放增多,使心脏兴奋性增强,心肌耗氧量增加,心肌的异位节律点兴奋性增强,自动节律增加,而产生心律失常,期前收缩甚至室颤;另一方面垂体-肾上腺皮质系统活动增强,盐皮质激素释放增加,使体内钾离子平衡失调造成低钾、低钙,而导致心律失常的发生。国内对应激性心律失常的研究较少,而实验研究只占其中的一小部分,并且只是一般的 ECG 或酶学等观察。 西药用于心律失常的治疗普遍存在致心律失常作用(proarrhythmia),以及负性变力性、脏器毒性作用等毒副反应,中药复方治疗心律失常,不但有较好的疗效,而且毒副作用小。目前还没有复方有效部位用于抗心律失常研究的报道,也没有一种专门用于应激性心律失常的中药治疗药物。本课题所研究的复脉汤是清朝古方,由西洋参、甘草、麦冬等五味药组成,有益气滋阴复脉功效,用于气阴不足,心亏气虚之心悸,口干舌燥,脉结代。本方药物即有抗心律失常作用,也有抗应激作用。并有处方药物少,用量小,有效成分较明确等优点,利于进行深入研究、开发出有效部位成药。 本课题首次采用全方合并提取,分离纯化复脉汤抗心律失常总皂苷有效部位,并用于抗应激性触发活动的研究,观察其抗应激性心律失常的作用及作用机理。用电生理(单相动作电位、玻璃微电极技术)、分光光度法、荧光分光光度法、流式细胞仪、透射电镜等多种方法,从整体、离体、细胞等多层次分析了应激对触发活动和心肌损伤的影响,并观察复脉汤及其有效部位的作用及其机制,主要结果如下:1. 中药化学研究 复脉汤为治疗气阴两虚之心动悸、脉结代的古方。经我们初步的临床观察,该方对频发的房早、室早等有较好的疗效,其传统的用法是水煎服,不但杂质多,且不便于推广应用。为把复脉汤这一有效古方开发成安全、高效、低毒、有效成分明确、服<WP=6>iv 复脉汤有效部位的提取及抗应激性心律失常的作用与作用机制研究用方便等优点的现代复方制剂,我们对复脉汤的提取方法、提取工艺、复脉汤有效部位的提取工艺进行了研究。我们以往大量的炙甘草汤和复脉汤实验研究以及文献证明,复脉汤抗心律失常作用的物质基础与炙甘草汤相似,也是甘草酸、人参总皂苷等皂苷类成分,且西洋参中人参总皂苷以人参皂苷 Rb1含量最高,因此实验研究中以甘草酸及人参皂苷 Rb1两种有效成分的含量为主要考察指标。1.1 复脉汤提取方法的研究:在尽可能相似的条件下,比较了几种常用的提取方法(水煎煮、渗滤法、温浸法)提取对复脉汤有效成分含量的影响,HPLC 测定上述提取方法所得浸膏中甘草酸及人参皂苷 Rb1的含量,并用恒重法测定各浸膏中的总固体量。结果表明,乙醇温浸法(饮片)所得的有效成分含量高且杂质相对较少,因此选择该方法作为复脉汤的提取方法。1.2 复脉汤提取工艺的研究:在选定提取方法的基础上,用均匀试验对复脉汤乙醇温浸法(饮片)进行了工艺研究,考察对结果影响较大的乙醇浓度、乙醇用量、温度及提取时间,四个因素各选三水平,选择 U9(94)均匀表安排实验,并用 HPLC 测定各次实验所得浸膏中甘草酸及人参皂苷 Rb1的含量。结果表明,复脉汤乙醇温浸法(饮片)的较优提取工艺为:10 倍药材量的 50%乙醇于 60℃温浸 4h(第一次 2h,第二、三次各 1h)。1.3 复脉汤有效部位的提取工艺研究:采用大孔树脂对复脉汤粗提物进行纯化,在相同的洗脱速度(1mL·min-1)和洗脱量(6 倍量树脂柱床体积,6BV)条件下,考察不同浓度乙醇洗脱对结果的影响,分别测定各浓度洗脱液中甘草酸的含量(HPLC 测定)和人参总皂苷含量(分光光度法测定),以甘草酸+人参总皂苷为复脉汤有效部位,根据结果确定复脉汤有效部位的大孔树脂提取工艺。结果表明用 6 BV 的低浓度乙醇洗脱后