目的:膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，膀胱癌的发病率逐年升高，90％的膀胱癌为尿路上皮细胞癌，在尿路上皮癌中有约70％为非肌层浸润性膀胱癌。膀胱癌术后生存率较高，约10-15％的病人可发展为肌层浸润性膀胱癌。浸润性膀胱癌恶性程度高，预后较差。微量元素及其相关离子蛋白参与膀胱癌的发病过程。由于膀胱癌的复发率较高，现在的控制手段多为膀胱灌注化疗，且目前治疗膀胱癌的方法主要在抑制膀胱癌细胞的增殖及诱导其凋亡这方面展开。微量元素过多或过少都会引起相关的疾病，并且关于微量元素及其相关转运蛋白在恶性肿瘤的机制研究受到越来越多的关注。相关研究表明镁离子及其相关蛋白通过参与细胞增殖、分化和凋亡过程中的调控在细胞代谢中起到重要的作用，镁的缺乏会导致癌症发生，其主要机制与蛋白质代谢和免疫系统呈相关性。关于镁的调控蛋白TRPM7在乳腺癌、直肠癌、前列腺癌的相关研究已被发表，但TRPM7在膀胱癌中表达情况及相关作用机制研究较少。MircoRNA(miRNA)是一类具有内源性调控功能的非编码RNA，多数位于恶性肿瘤的基因组区域内，在多种肿瘤组织中表达异常，说明miRNA参与恶性肿瘤发生发展，与肿瘤的发生发展、细胞增殖、凋亡和侵袭等有密切的关系，被认为可能引起抑癌基因或癌基因的作用。所以本文主要通过对miR-30a及其靶基因镁调控蛋白TRPM7在膀胱癌中的研究，深入了解膀胱癌的发病机制并为分子靶向治疗提供理论基础。　　研究方法:　　1实验材料　　1.1细胞系:膀胱癌细胞系:SV-HUV-1，RT4，BIU87，5637，T24，SW780，UM-CM-3及人胚肾细胞系HEK293;　　1.2组织标本:均源于中国医科大学附属第一医院泌尿外科2011年6月-2015年6月的病例。本实验收集了36对手术切除的膀胱癌及其癌旁组织，于-80℃冰箱中保存，所有的组织标本都经过病理学检查确诊，所有采纳的标本均经由中国医科大学医学伦理委员会批准。　　2实验方法　　2.1检测TRPM7在膀胱癌组织中的表达情况。　　2.1.1利用RT-PCR法检测膀胱癌组织中TRPM7的mRNA表达情况;　　2.1.2利用Western-blot法检测膀胱癌及癌旁正常组织中TRPM7蛋白的表达情况;　　2.1.3利用免疫组织化学法检测膀胱癌及癌旁正常组织中TRPM7蛋白的表达情况;　　2.2检测膀胱癌细胞系中TRPM7的表达情况。　　2.2.1利用免疫荧光法检测膀胱癌细胞系中TRPM7蛋白的定位情况;　　2.2.2利用RT-PCR法检测膀胱癌细胞系中TRPM7mRNA的表达水平;　　2.2.3利用Western-blot法方法检测膀胱癌细胞系中TRPM7的蛋白表达水平。　　2.3设计3种siTRPM7瞬时转染膀胱癌细胞，转染48小时后收集细胞，分别提取处理细胞的总RNA及总蛋白，采用RT-PCR和Western Blot方法分别检验转染后TRPM7的mRNA和蛋白表达水平，选取敲除效率最高的siTRPM7行进一步实验。　　2.4特异性沉默TRPM7后，检测对膀胱癌细胞5637，T24的增殖、迁移和侵袭能力的影响，以及转染前后凋亡水平的变化。　　2.4.1 CCK8法检测沉默TRPM7前后膀胱细胞的增殖能力变化;　　2.4.2划痕实验、transwell实验检测敲除TRPM7后膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力变化;　　2.4.3流式细胞术检测沉默TRPM7前后膀胱癌细胞的凋亡水平变化。　　2.5采用Realtime-PCR法检测在膀胱癌和癌旁正常组织中，以及膀胱癌细胞系中miR-30a的表达差异。　　2.6利用Realtime-PCR和Western Blot检测miR-30a对TRPM7的沉默效应。　　2.7通过荧光素酶报告基因验证miR-30a与TRPM7mRNA-3UTR的结合作用及结合位点。　　2.8采用CCK8、AnnexinⅤ-PI双染法及PI单染法分别检测miR-30a转染膀胱癌细胞后增殖、凋亡及细胞周期的变化。　　2.9通过miR-30a敲除TRPM7和过表达STAT3共转染的方法验证TRPM7在膀胱癌中的作用机制。　　结果:　　1 TRPM7在膀胱癌组织中的表达情况:　　1.1 RT-PCR与Western Blot结果显示，膀胱癌组织中的TRPM7mRNA和蛋白水平明显高于正常组织;　　1.2免疫组化检测结果显示，与正常组织对比，TRPM7在膀胱癌旁上皮细胞中呈阳性表达，明显高于在癌旁正常组织中的表达。　　2 TRPM7在膀胱癌细胞系中的表达和定位情况:　　2.1 RT-PCR与Western Blot检测结果显示，在膀胱癌细胞5637，T24中的TRPM7mRNA和蛋白的表达水平均明显高于膀胱细胞BIU87;　　2.2免疫荧光实验结果显示，TRPM7蛋白主要位于膀胱癌细胞质，且随着膀胱癌的恶性程度增高，有向核膜聚集的趋势。　　3利用前期检测结果，我们选择TRPM7表达量相对较高的T24细胞作为研究对象，按照Lipo3000的说明书瞬时转染3种TRPM-siRNA，检测TRPM7的mRNA和蛋白的敲除水平，选择敲除效率最高的TRPM-siRNA1作为进一步的功能实验的研究。　　4应用CCK8，划痕试验和Transwell实验分别检测5637，T24细胞敲除TRPM7后增殖、迁移和侵袭能力的变化情况。结果显示，转染TRPM7-siR1后5637，T24细胞的增殖，迁移及侵袭能力显著降低，差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。　　5将TRPM-siRNA1转染5637、T24细胞48小时后，采用流式细胞仪方法检测，结果表明较阴性对照相比，促进了细胞凋亡，差异具有统计学意义(P＜0.05)　　6采用RT-PCR检测膀胱癌组织和癌旁正常组织，及膀胱癌细胞系中miRNA-30a-5p的表达情况，结果显示miRNA-30a-5p在膀胱癌中明显低于癌旁组织;在膀胱癌细胞系中，miRNA-30a-5p在高恶性程度的膀胱癌细胞中表达量低于低恶性程度的膀胱癌细胞。　　7 Real-time PCR和Western-blot结果显示，与阴性对照组相比，miR-30a mimics转染组膀胱癌细胞中TRPM7 mRNA及蛋白表达水平下降(P＜0.05)，提示miR-30a在转录水平抑制TRPM7的表达。　　8 Luciferase检测结果显示，Lut-TRPM7-Wt+miR-30a共转染HEK293细胞组报告基因活性对于其它各组显著降低(P＜0.05)，证实TRPM7是miR-30a的靶基因。　　9 miR-30a靶向抑制TRPM7表达抑制了膀胱癌细胞的EMT　　9.1通过Transwell实验检测发现诱导miR-30a表达可以抑制膀胱癌的侵袭和迁移能力;　　9.2转染miR-30amimic后，膀胱癌细胞EMT过程受到抑制，E-Cadherin表达增高，N-Cadherin和Vimentin表达降低。　　10 miR-30a通过下调TRPM7抑制了膀胱癌细胞的增殖，迁移和侵袭，并且促进了膀胱癌细胞的凋亡　　10.1在膀胱癌细胞5637、T24中进行miR-30a、空白对照和miR-NC的转染，分别实行CCK8法、流式细胞周期分布测定法和流式细胞凋亡测定法对转染后的细胞活性、细胞周期分布率和凋亡率进行评估。转染miR-30a后，5637、T24细胞的增殖能力受到明显抑制;流式细胞仪测细胞周期结果显示，经miR-30a转染后，跟阴性对照组相比5637、T24细胞被阻滞在G2/M期，有统计学意义(P＜0.05);流式细胞仪测细胞凋亡结果显示，miR-30a转染后的5637、T24细胞，细胞凋亡率和阴性对照组比较显著增加，且主要表现为晚期凋亡;　　10.2转染miR-30a mimic后，Western-blot法检测发现膀胱癌细胞5637、T24的caspase3，PARP活化水平均得到明显提高;　　10.3转染miR-30amimic后，检测发现膀胱癌细胞5637、T24内的靶蛋白TRPM7明显降低，并且其下游蛋白p-JAK2，p-STAT3、ALDH1表达明显明显降低，但t-JAK2，t-STAT3、p-AKT、t-AKT蛋白的表达无明显变化。　　11 miR-30a和pcDNA-STAT3共转染后恢复了膀胱癌细胞5637、T24的增殖能力，ALDH1蛋白也恢复到对照组水平。　　结论:1、TRPM7在膀胱癌组织和细胞系中高表达，为癌基因，沉默TRPM7可促进膀胱癌细胞的凋亡，抑制增殖、迁移和侵袭。2、人膀胱癌组织中miR-30a的表达低于癌旁正常组织，与膀胱癌细胞系的恶性度呈负相关，说明miR-30a在膀胱癌中为抑癌基因。3、miR-30a与TRPM7 mRNA-3UTR存在结合位点，说明TRPM7为miR-30a的靶基因。4、miR-30a通过下调TRPM7的表达，抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭，参与调控膀胱癌的EMT过程。5、miR-30a通过下调TRPM7的表达，抑制了膀胱癌细胞增殖，阻滞了细胞周期进程，并促进其凋亡，在共转染pcDNA-STAT3后，其增殖能力得到恢复，说明miR-30a下调其靶基因TRPM7是通过JAK2-STAT3途径来调控膀胱癌细胞的增殖。