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食物过敏已经成为中国乃至世界范围关注的重大公共食品卫生安全问题。为确保公众健康安全,食物过敏问题必须时刻被关注。食物过敏至今为止尚无特效治疗法,预防食物过敏的重要途径是严防接触过敏原。目前,低敏性食品的开发研究和食品过敏原的检测分析已经成为当今过敏原研究的焦点。本文以牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)纯品为材料,将超高压(High Hydrostatic Pressure,HHP)技术和中低温处理相结合。研究了 HHP协同温度处理对BSA分子结构、结合动力学和结合热力学的影响,初步探讨了 HHP对BSA结构的影响及抗原性的变化。1.间接竞争ELISA方法的建立本文采用过敏原BSA纯品免疫BALB/c小鼠,制得鼠抗BSA的单克隆抗体,并以BSA纯品作为包被抗原、自制抗体作为一抗,辣根过氧化物标记羊抗鼠IgG为酶标二抗,四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)显色液为底物,建立了敏感、特异的间接竞争联免疫方法。间接竞争酶联免疫方法的最佳抗原包被浓度为0.25μg/mL,单抗最佳工作浓度为1:32000,酶标二抗最佳工作浓度为1:10000,最低检测限为6.71 ng/mL,线性检测范围为3.5938～460 ng/mL。曲线回归方程为y=-47.4489x+ 135.8663,相关系数为0.9973。该方法与马血清、猪血清、兔血清、羊血清、狗血清、鸡血清、小鼠血清均无交叉反应。该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于过敏原BSA的快速检测。2.基于蛋白相互作用传感器对牛血清白蛋白与抗体结合能力变化检测方法的初探本文采用CM5芯片,进行抗原抗体最佳工作浓度等实验条件的优化,基于蛋白相互作用传感器对牛血清白蛋白与抗体结合能力变化检测方法的初探,为BSA与抗体动力学及热力学常数的测定建立了方法。蛋白相互作用检测方法抗体的最佳耦联浓度为100μg/mL,BSA的最低检测值为1.6nmol/L,回归线方程y=0.10462x+8.1897,相关系数为0.9975,将动力学常数测定中的BSA的浓度梯度范围确定为156nmol/L,312 nmol/L,625nmol/L,1.25μmol/L,2.5μmol/L和 5μmol/L。芯片再生液为pH=2.0的甘氨酸-盐酸溶液,作用时间为30 s。3.超高压协同温度处理对BSA结构及抗原性的影响超高压处理不改变BSA的一级结构,但对二级结构及三级结构有不同程度的影响。压力产生的物理作用和升温产生的热效应共同作用于BSA蛋白分子后,其二级结构变化主要表现为α-螺旋含量减少,β-折叠、β-转角和无规卷曲等结构含量呈增加趋势,引起天然构象中的氢键结构紊乱。三级结构中,蛋白表面疏水性,活性疏基含量,内源荧光强度均呈现先增加后减少的趋势。内源荧光强度的下降表明HHP作用使BSA分子伸展,色氨酸残基周围环境的疏水性增加,部分芳香族氨基酸残基包埋于分子内部。同时,一些原来包埋于BSA蛋白质分子内部带的氨基酸残基暴露于分子表面,蛋白疏水性增加,二硫键断裂。但随处理压强和温度和升高,引发蛋白质分子聚集,一些较大的聚集体可能还会发生沉淀,导致原本暴露的疏水基团重新包埋于分子内部,疏水性降低,活性巯基之间重新缔合形成二硫键。利用已建立的ELISA方法,对超高压处理的BSA进行抗原性检测,结果发现:超高压协同温度处理能有效降低过敏原BSA的抗原性。本研究还对BSA抗原性与α-螺旋结构变化进行了相关性分析,通过线性拟合分析分别建立两者之间关系模型,两者均呈现出显著正相关性(P<0.05),进一步证实了过敏原BSA抗原性与α-螺旋紧密相关,α-螺旋含量的变化将会引起蛋白质构象的改变,从而使其抗原性降低。三级结构中二硫键的断裂和疏水基团的暴露改变了 BSA及其抗原决定簇的空间结构,导致抗原性降低。动力学和热力学数据显示,超高压诱导下BSA与抗体结合解离加快,稳定性降低,平衡解离常数KD增加,BSA与抗体结合的亲和力下降。反应由常温常压条件下的熵驱动变为焓驱动,结合的主要作用力由天然状态下的典型疏水作用变为氢键和范德华力。