[目的]肝脏纤维化是由于肝脏纤维过度沉积、增生和降解失衡的结果,是各种慢性肝病向肝硬化、肝癌发展的必经阶段,是所有慢性肝病的共同病理基础。虽然肝纤维化发病率高,但目前对其发病机制尚不完全清楚,并且没有根本有效的抗纤维化治疗药物。本论文在成功创建FKBP5基因敲除小鼠肝脏纤维化模型的基础上,探究FKBP5在肝脏纤维化发生中的作用,以期望寻找预防和治疗肝脏纤维化的新靶点。[方法]将野生型(WT)小鼠共6只平均分为两组:正常对照组(WT-CON)和CCl4处理组(WT-CCl4);Fkbp5 KO小鼠共6只平均分为两组,正常对照组(KO-CON)和CCl4处理组(KO-CCl4)。1)肝脏病理学分析。对四组小鼠肝脏切片,通过Masson染色方法,对胶原沉积进行染色,观察WT和KO小鼠肝脏组织病理学差异;2)利用免疫荧光染色实验,对纤维化标志分子α-SMA、TIMP1、CollagenⅠ进行检测,从蛋白表达水平检测肝脏纤维化发生程度;3)利用Real-time PCR技术,检测纤维化相关标志分子Collagen Ⅰ、TIMP1、MMP2、CTGF、TGF-β、α-SMA在mRNA水平的表达情况,检测这四组小鼠肝脏纤维化发生情况;4)TGF-β信号通路分析。通过Real-time PCR和Western Blot的分子实验方法,对TGF-β信号通路标志性分子的表达情况进行检测。5)对线粒体形态变化。对四组小鼠肝脏组织的电镜拍照,利用软件对每个线粒体的面积进行测量,数据用GraphPad Prism5处理,分析线粒体大小变化显著性差异,并通过电镜观察线粒体自噬情况;6)利用Western Blot技术对线粒体自噬相关蛋白parkin以及pink1的表达情况进行检测;7)RNA表达谱测序分析。分别提取四组小鼠肝脏组织的RNA,利用第二代测序技术,对WT/KO-CON以及WT/KO-CCl4四组的RNA进行测序分析,探究FKBP5 KO小鼠和WT小鼠对照组和注射CCl4后的基因表达情况以及对其差异基因进行分析。[结果]1)通过Masson染色观察肝脏组织的病理变化发现:CCl4处理组在汇管区均出现绿色的胶原沉积现象,并且FKBP5 KO小鼠的胶原沉积程度要轻于WT小鼠;2)利用免疫荧光实验对α-SMA、TIMP-1、Collagen Ⅰ三种肝脏纤维化发生的标志分子进行检测发现:与对照组相比,三种蛋白在CCl4处理组的表达量均升高,同时KO-CCl4组的表达量要低于WT-CCl4组;3)进一步通过Real-time PCR技术对几种肝脏纤维化发生的标志分子在mRNA水平的表达进行检测发现:与对照组相比较,CCl4组的α-SMA、TIMP-1、Collagen Ⅰ、CTGF 以及 TGF-β1 这五种分子在 mRNA的表达显著上调;而MMP2的表达被下调;4)利用Western Blot和Real-time PCR技术对TGF-β/Smad信号通路相关分子检测:纤维化正调控因子TGF-β1、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad2/3、TGF-β R Ⅰ、TGF-β RⅡ 以及负调控因子 Smad2、Smad7在WT-CCl4组中的表达均高于KO-CCl4,这一结果表明WT-CCl4组小鼠的纤维化程度严重于KO-CCl4组,同时WT-CCl4组小鼠机体抵抗肝脏纤维化发生的反应更强;5)线粒体大小测量结果显示,KO-CON组和KO-CCl4的肝脏线粒体分别大于WT-CON和WT-CCl4组;同时肝脏电镜结果显示KO-CCl4组小鼠的线粒体自噬情况较WT-CCl4组严重;6)Western Blot检测发现KO-CCl4组小鼠的线粒体自噬相关蛋白parkin和pink1的表达高于WT-CCl4组;7)RNA-seq分析结果表明:在WT/KO-CCl4处理组中,由于敲除Fkbp5基因,导致脂代谢、应激过程、CYP450代谢以及氧化还原过程等生物学过程发生改变。[结论]1)敲除Fkbp5基因可以抵抗CCl4诱导的小鼠肝脏纤维化;2)Fkp5基因可能通过TGF-β/Smad信号通路调节小鼠肝脏纤维化;3)Fkbp5基因可能通过影响线粒体自噬过程影响肝脏纤维化;4)RNA-seq结果分析发现Fkbp5基因可能通过脂代谢、应激反应过程、CYP450代谢等多个生物过程共同调节肝脏纤维化;[目的]很多研究已经证实,应激反应与代谢调节之间具有一定的相关性,但是应激对代谢的影响以及内在分子机制仍不清楚。缺氧对机体是一种慢性应激过程。FKBP5(FK506结合蛋白)作为一种应激反应相关蛋白,在涉及到应激反应和代谢调节中可能具有重要的作用。因此本实验的目的是探讨缺氧刺激对原代WT和FKBP5 KO MEFs脂肪形成的影响以及FKBP5在缺氧条件下对脂肪形成的调控机制。[方法]1)原代成纤维细胞的分离和培养:利用野生型(WT)和FKBP5基因敲除(KO)小鼠的胚胎分离得到相应的原代成纤维细胞并培养;2)脂肪诱导分化实验:分别在常氧(21%02)和低氧(5%02)条件下进行脂肪诱导分化实验,观察低氧对WT和FKBP5KO细胞成脂分化的影响;3)油红O染色:利用油红O对脂肪诱导第6天的细胞进行染色,观察脂滴积累的多少;4)利用Western Blot检测低氧以及脂肪诱导过程中FKBP5蛋白表达的变化情况;5)Real-time PCR检测脂合成、脂降解以及能量代谢相关基因的mRNA表达情况。[结果]1)常氧条件下,FKBP5KO细胞的脂滴积累显著少于WT细胞;2)低氧条件下,WT和KO细胞的脂滴积累较常氧条件下增多,但是KO细胞的脂滴积累仍少于WT细胞;3)Western Blot检测结果发现:在0到24小时内,FKBP5的表达随着低氧处理时间的增加而降低;在脂肪诱导实验过程中,无论在常氧和低氧条件下,FKBP5蛋白的表达均呈现先升高在降低的变化趋势,这表明FKBP5主要在脂肪诱导过程的早、中期具有促进脂滴形成的作用;4)Real-time PCR结果显示:在低氧条件下的脂肪诱导分化过程中,WTMEFs的脂肪合成基因(CD36、Glut4和aP2)、脂降解基因(GDPD1和Adiponectin)以及能量代谢基因(UCP1)的表达较常氧条件被下调;而FKBP5 KOMEFs的脂肪合成基因以及UCP1被上调,脂降解基因表达被下调,最终表现为低氧促进了 WT和FKBP5 KO MEFs的脂滴形成和积累。[结论]1)低氧促进WT和FKBP5 KO MEFs的脂滴形成和积累2)低氧通过调控FKBP5基因的表达影响脂滴的形成和积累3)低氧通过影响脂肪合成、脂肪分解和能量代谢三条通路调节WT和FKBP5 KO MEFs的脂滴形成和积累