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1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus, T1DM)是儿童及青少年较常见的内分泌疾病,发病率逐渐上升,并且近年来呈现发病年龄早、病情重的趋势,是-种严重威胁儿童健康的重要疾病。从胰岛β细胞发生自身免疫性损伤到出现糖尿病症状往往需要一个较长的过程,因而针对1型糖尿病免疫调节治疗越来越受到重视。目前常用的免疫调节治疗主要集中在抗原特异性、抗原非特异性免疫调节治疗和促进胰岛β细胞再生等措施方面,这些措施的联合应用也就是所谓的鸡尾酒疗法,有可能实现在较低的毒副作用基础上达到更有效的干预效果。因此本课题尝试在T1DM发病前期应用白细胞介素10 (interleukin-10, IL-10)进行免疫干预,逆转Th1/Th2偏移,阻止胰岛β细胞的自身免疫性损害；并联合应用胰岛素样生长因子-1(insulin growth factor-1, IGF-1)保护残存的β细胞功能,促进β细胞再生,以期达到预防或减轻T1DM的目的。由于这两种细胞因子半衰期都较短,限制了其应用,所以我们前期已经构建完成携有这两种细胞因子的腺病毒载体,并且已经完成腺病毒介导IGF-1基因的细胞学验证(注：IL-10腺病毒载体由本人硕士期间构建,IGF-1腺病毒载体由本课题组其他成员构建完成并通过细胞学验证)。本研究将IL-10基因作用于体外培养的β细胞以了解其对胰岛β细胞的作用,并进一步将IGF-1基因和/或IL-10基因作用于非肥胖性糖尿病(nonobese diabetic, NOD)鼠体内,以了解其对T1DM防治作用及可能的机制。本课题共包括两部分。第一部分目的了解鼠白细胞介素10(mIL-10)基因转移对细胞因子诱导的RINm5F胰岛β细胞凋亡及胰岛素释放功能的影响,以探讨其对1型糖尿病的潜在治疗价值。方法携带有IL-10基因的重组腺病毒载体Ad-IL-10感染RINm5F, RT-PCR、Western印迹及酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测IL-10基因和蛋白表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)分析细胞活力。检测加入白细胞介素1-β(IL-1β)诱导细胞破坏后,Ad-IL-10对糖刺激胰岛素释放实验的影响；对培养上清中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)水平的影响；Hoechst33258核染色分析细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞表面Fas表达。结果RINm5F细胞中检测到mIL-10基因及蛋白的有效表达,细胞培养液中可测得IL-10基因表达。IL-10重组腺病毒感染胰岛p细胞后仍具有在高糖浓度下刺激胰岛素分泌的功能；将IL-1β作用于细胞后,Ad-IL-10可以部分对抗IL-1β引起的糖刺激胰岛素分泌降低,较其他2组相比差别有统计学意义(P<0.05)。RINm5F细胞中加入IL-1β后,可增加细胞培养液中NO、NOS水平、Fas表达阳性细胞数和胰岛细胞凋亡率,Ad-IL-10感染后可以降低NO、NOS水平,减少Fas表达阳性细胞数,减低胰岛细胞凋亡率,较正常对照+IL-1β组及Ad-GFP+IL-1β组,差别有统计学意义(P<0.05)。结论携有IL-10基因的重组腺病毒载体作用于胰岛素分泌细胞,IL-10 mRNA和蛋白可有效表达,胰岛β细胞活力不受影响。IL-10基因可抑制IL-1β诱导的糖刺激胰岛素分泌降低并通过抑制细胞表面Fas表达而起到抗凋亡作用。第二部分目的观察腺病毒介导的胰岛素样生长因子-1(Ad-IGF-1)和/或白细胞介素10基因(Ad-IL-I0)对非肥胖性糖尿病鼠(NOD)鼠胰岛炎及胰岛β细胞凋亡的影响及其对胰岛β细胞的保护作用。方法雌性NOD鼠随机分为Ad-IGF-1组、Ad-IL-10组、Ad-IGF-l+Ad-IL-10组、腺病毒空载体Ad-GFP组、生理盐水对照组。分别腹腔注射Ad-IGF-1、Ad-IL-10、Ad-IGF-1+Ad-IL-10、Ad-GFP,生理盐水各100ul,3周后重复1次。每周监测血糖,体质量变化及糖尿病发病率。免疫组化检测胰腺IGF-1、IL-10表达,ELISA法检测血清IL-10、IGF-1及胰岛素水平,病理学检查胰岛炎程度,TUNEL法观察胰岛细胞的凋亡并计数胰岛β细胞凋亡率,免疫组化分析各组Fas, Caspase-3蛋白表达。结果腹腔注射Ad-IGF-1、Ad-IL-10可使IGF-1、IL-10在胰腺表达增强,IGF-1、IL-10单基因治疗可以减少糖尿病的累积发病率,延缓糖尿病的发生,增加体质量,IGF-1+IL-10联合治疗组较以上效果更加明显,P<0.01。Ad-IGF-1组、Ad-IL-10组胰岛炎积分、β细胞凋亡率均明显低于Ad-GFP组及生理盐水组(P<0.01),而Ad-IGF-1+Ad-IL-10组胰岛炎积分、β细胞凋亡率低于Ad-IGF-1组、Ad-IL-10组(P<0.01)。免疫组化显示IGF-1、IL-10单基因干预可使Fas、Caspase-3蛋白低表达,联合基因干预组较单基因干预组Fas、Caspase-3蛋白表达水平更低,P<0.01。结论应用Ad-IGF-1、Ad-IL-10腹腔注射均可以减少NOD鼠的胰岛炎和糖尿病的发生,而工L-10、IGF-1联合基因治疗,既可发挥工L-10良好的细胞免疫调节和p细胞保护作用及应用IGF-1促进胰岛β细胞重建和再生的作用,通过Fas途径减少细胞凋亡,从而更好的保护胰岛β细胞功能。