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细菌内毒素(也称内毒素)是革兰氏阴性细菌细胞壁结构中的类脂多糖体(脂多糖,LPS),此种脂多糖经细菌胞壁合成后被转运到细胞表面构成胞壁外膜的组成成分,在细菌死亡溶解溃后从细胞结构中释放出来。内毒素生物活性复杂,对人体作用广泛,能使脏腑组织发生严重病变,可引起休克、弥散性血管内凝血(DIC)、多器官功能衰竭等。小剂量的LPS即可引起广泛的生物学作用及病理学反应,如内毒素血症、休克肺、心脏抑制及口腔疾患等,死亡率高达20%~60%。
大黄为常用中药,具有泄下、抗菌、抗肿瘤、抗高脂血症,降低血压、健胃、利胆保肝、强心、消炎、延缓衰老、调节免疫等作用。近代研究证明,大黄具有清除体内氧自由基,调节免疫等重要药理活性。现已从大黄中分离到蒽醌、二蒽酮芪、苯丁酮、单宁、萘、色酮等不同种类的80种化合物,大体上分为蒽醌类、多糖类、鞣质。
本实验分别以水和乙醇为溶剂,对大黄进行提取,通过正交实验,比较了两种溶剂对大黄的提取效果。实验发现:以水为溶剂时,煎煮次数对大黄总蒽醌提取物具显著性影响(P<0.05),煎煮次数和浸泡时间对结合型蒽醌具有一定影响(0.05<P<0.1),煎煮次数较多,3种物质的提取率越高,这说明浓度差是大黄有效成分浸出的重要因素。对总蒽醌而言,浸泡比不浸泡提取率要-1-高。但浸泡0.5h与浸泡12h无显著性差异,而结合型及还原型蒽醌则以不浸泡或浸泡0.5h为好,提示两者在水中的不稳定性。煎煮时间在60min之内,对总蒽醌无显著影响(P>0.1),而结合型蒽醌则以30min煎出量最高,还原型蒽醌以10min最高。这亦说明,加热时间长,对后两种的稳定性会产生一定的影响。以乙醇为溶剂的正交试验结果可看出,乙醇浓度为80%,回流时间1小时,回流次数2次,溶剂量为10倍。对于总蒽醌含量而言,以乙醇为溶剂,回流次数仍是最重要的因素。乙醇浓度和回流时间对还原型蒽醌具显著性影响(P<0.05),而加醇量则具一定影响(0.05<P<0.1)。从实验结果可看出,水提组与醇提组比较,醇提组对3种大黄组分的提取效果明显优于水提组,醇提组中,以80%乙醇为优,且煎煮时间均不宜过长,控制在1左右为宜。
为进一步将大黄中的有效成分分离,对大黄的乙醇初提物在不同的甲醇比例下进行分离,实验发现,当氯仿:甲醇:水=4:3.8:2时的分离结果最好。使用前使两相溶剂系统在分液漏斗中充分振荡,让其两相间彼此尽量饱和,然后再静置分层,取上相做固定相,下相做移动相。上机条件为流动相流速2.00mLmin,仪器转速800r/min的分离条件。最后得到6种单一的蒽醌类物质。
将大黄中蒽醌类提取物用于大鼠,检测其抗内毒素作用。检测血浆内毒素浓度发现,大黄中蒽醌类提取物能有效抑制大鼠血浆内毒素浓度。在其提取物中,起有效作用的为其中的结合型蒽醌类提取物。结合型蒽醌对大鼠血浆内毒素的抑制效果与用药剂量及用药时间有关。试验表明,有效的用药剂量为300mg/kgd~400mg/kgd,每日2次,用药周期1个月。