同种器官移植已成为治疗人类肾脏、心脏、肝脏等严重疾病的一种重要手段。而移植排斥反应导致移植器官功能的丧失仍是临床上未能解决的一个主要问题。已知移植器官内针对移植抗原特异性反应的T细胞的炎性浸润是导致排斥反应的重要原因。而T细胞的浸润是黏附分子、细胞因子等多因素参与的结果，其中趋化因子在招募T细胞浸润到移植物局部扮演着重要角色。 已有的文献报道表明，趋化因子表达水平的升高与急性移植排斥反应密切相关，通过下调趋化因子的表达，可以减轻移植物局部的炎症反应，延长移植物的存活。由于趋化因子大约有60个成员，包括四个亚家族，每个亚家族又有不同数量的趋化因子，目前的研究尽管对某一个或者某一些趋化因子在急性移植排斥反应中的表达以及作用有一些了解，但对四个亚家族中众多趋化因子的表达还不是很清楚。而阐明趋化因子表达谱的情况将有助于提供趋化因子在急性移植排斥中表达情况的一个全景，进而又利于寻找表达水平有明显变化的趋化因子，通过干预显著变化的趋化因子的水平从而达到延长移植物存活的目的，为延缓急性移植排斥反应的发生提供新的靶点。 因此，本研究以小鼠皮肤移植模型为基础，通过对四个亚家族中11个趋化因子表达谱的检测，寻找表达水平显著变化的趋化因子，通过干预变化程度最明显的趋化因子的表达从而达到减轻炎症细胞浸润，延长移植皮片存活的目的。 第一部分 皮肤移植中ChKs表达谱的检测 为了检测皮肤移植急性排斥反应中趋化因子表达谱的变化，我们首先建立小鼠皮肤移植急性排斥模型，确定移植皮片排斥时间。C57BL/6小鼠的皮肤移植给BALB/c小鼠，同时进行同基因皮肤移植，术后7天拆除绷带，每天观察皮肤的色泽、湿润程度，干痂坏死达到80％以上判定为皮肤移植排斥的终点。异基因移植组皮片平均存活时间为11.57±0.79天，同基因移植皮片一直到观察期结束(20天)仍生长良好，并逐渐长出毛发，无排斥反应出现，说明移植手术成功。 然后，我们在皮肤移植后早期(第3天)、中期(第7天)和晚期(第11天)，用RT-PCR的方法检测趋化因子四个亚家族中11个趋化因子的mRNA水平。结果显示：在移植排斥的早期，MIP-1α、MIP-3α和CTACK表达明显升高；中期，CXCL16、I-TAC、LYN、IP-10和Mig在异基因移植皮片内也上调表达，在排斥后期，表达水平进一步增高；而RANTES，FKN，TARC在异系移植和同系移植皮片内的表达无明显差异。在表达水平升高的趋化因子中，I-TAC的升高幅度最大，在移植排斥的第7天，I-TAC在异系移植皮片内的表达水平是同系移植的7.570倍，第11天上升为8.882倍。提示我们I-TAC可能在急性皮肤移植排斥中发挥重要的作用。因此，我们选择I-TAC作为本研究的靶向趋化因子。 第二部分I-TAc在急性皮肤移植排斥反应中的作用 从第一部分结果发现，移植皮片局部I-TAC mRNA的表达显著上调。已知I-TAC可以特异性趋化CXCR3阳性细胞，而CXCR3在移植排斥反应中发挥重要的作用。所以，我们首先用免疫组化的方法检测了皮片移植后早期、中期和晚期I-TAC以及CXCR3的表达变化。结果显示：异系移植皮片随着排斥反应的进程，炎性浸润细胞逐渐增多，I-TAC和CXCR3的表达也相应增强。早期只有少量细胞浸润，未检测到I-TAC及CXCR3在移植皮片内的表达；中期，炎性细胞浸润明显增多，I-TAC和其受体CXCR3的表达也显著增强；到移植排斥的晚期，大量细胞浸润到移植皮片内，表皮已形成痴皮，I-TAC和CXCR3的表达极度增强。同系移植的皮片结构保持完整，没有淋巴细胞浸润，也没有检测到I-TAC和CXCR3的表达。 为了进一步研究移植皮片内浸润淋巴细胞的功能，我们用胶原酶和0.25％的胰酶-EDTA混合液分离移植皮片内浸润细胞，将这群浸润细胞作为反应细胞，丝裂霉素灭活的供者脾细胞作为刺激细胞，进行混合淋巴细胞反应，用CCK-8的方法检测浸润细胞对异系移植抗原的特异性增殖能力，并用ELISA的方法检测混合淋巴细胞反应的培养上清中IFN-γ、TNF-α和IL-4的水平。结果显示：皮片局部浸润细胞能够对异系移植抗原产生特异性的增殖反应，并且具有分泌IFN-γ、 TNF-α和IL-4的能力。 第三部分 I-TAC在急性皮肤移植排斥反应中的作用机制 为了进一步研究I-TAC在急性皮肤移植排斥反应中的作用，我们在移植皮片局部注射I-TAC单克隆抗体(anti-I-TAC mAb)，以大鼠IgG2a作为对照，观察抗体注射后对皮片存活时间的影响。结果显示：注射抗体组和注射抗体对照组相比，移植皮片的平均存活时间延长了2-4天(14.29±0.95 vs.11.71±0.76天，p<0.05)。 进而我们用免疫组化的方法检测了移植皮片局部CXCR3阳性细胞的表达。在移植后第7天，注射anti-I-TAC mAb组和抗体对照组相比，炎性细胞浸润程度相当，CXCR3的表达情况无明显差异。但在移植后第11天，注射抗体组移植皮片内炎性浸润细胞数量明显减少，且CXCR3的表达水平也显著下降(69.20±4.324％/HPF vs.50.20±4.970％/HPF,p<0.05)。 随后我们分离了抗体注射后移植皮片局部的浸润细胞，采用和第二部分相同的方法检测抗体皮片下局部注射后对移植抗原特异性增殖能力的影响和分泌细胞因子水平的变化。结果显示：anti-I-TAC mAb在移植皮片局部注射后，与抗体对照组相比，并没有影响局部浸润细胞对移植抗原的特异性增殖能力，但可以显著减少IFN-γ(733-3±13.01 pg/ml vs.516.7±15.28 pg/ml)和TNF-α(72.67±3.51 pg/ml vs.52±3.61 pg/ml)的分泌水平。 以上结果提示，anti-I-TAC mAb在移植皮片局部注射后，I-TAC特异性招募到移植皮片内的CXCR3阳性细胞的数量显著减少，Th1型细胞因子的分泌水平随之下降，从而减轻了移植皮片局部的炎症反应，延缓了皮片的存活时间。 综上所述，通过对趋化因子四个亚家族中有代表性的11个趋化因子在小鼠皮肤急性移植排斥反应进程中的变化，发现MIP-1α、MIP-3α和CTACK的表达水平在早期即有升高，CXCL16、I-TAC、LTN、IP-10和Mig的水平在中期开始明显升高，到晚期，其水平达到高峰。RANTES，FKN，TARC的表达在整个移植排斥过程中没有显著变化。而在升高的趋化因子中，I-TAC的变化最为显著。移植皮片局部注射I-TAC单克隆抗体后可以显著延长皮片的存活时间，I-TAC招募过来的CXCR3阳性细胞的数量显著减少，局部浸润细胞分泌Th1型细胞因子(IFN-γ、TNF-α)的水平显著下降，从而延缓了移植排斥反应的发生。本研究为减轻急性移植排斥反应，延长移植物存活时间提供了新的靶点，从而为临床上减轻器官移植排斥反应提供了一种可能的策略。