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第一部分可降解生物材料PLGA仿生矿化的实验研究目的:通过对PLGA的仿生矿化表面改性,以提高其生物学活性;探讨影响仿生矿化的因素和条件,检测矿化过程对PLGA支架材料孔隙率及生物力学强度的影响,为进一步制备组织工程化人工骨提供依据和实验基础。方法:PLGA膜经碱性溶液水解处理后,应用高温显微镜测量材料表面润湿角的变化;碱处理后的PLGA膜和三维多孔PLGA分别在0.5倍SBF中矿化20天,在SBF中矿化14天,在1.5倍SBF中矿化9天,应用扫描电镜进行矿化物形貌观察,X射线能谱分析钙磷比值,X射线衍射仪和傅立叶转换红外光谱仪行矿化物物相分析,比重法测量矿化前后材料孔隙率的变化,津岛生物力学测试仪测试材料矿化前后抗压强度的变化。结果:PLGA经碱性溶液水解处理后表面亲水性明显增强,在0.5倍SBF中仅有少量矿物沉积,在SBF及1.5倍SBF中矿化后表面可以形成明显的矿化物;矿化物的形态与矿化液的浓度有关;矿化物主要成分为羟基磷灰石,含有碳酸根成分,钙磷比为1.53,类似于人骨无机质。仿生矿化前后PLGA支架材料的孔隙率分别为(84.86±8.52)%和(79.70±7.70)%,抗压强度分别为(0.784±0.156)N/mm2和(0.858±0.145)N/mm2,没有明显差别(p>0.05)。结论:PLGA仿生矿化是制备结构及性质类似骨基质人工骨的可行方法。第二部分大鼠BMSCs的分离培养和鉴定目的:大鼠BMSCs的体外获取并鉴定,为进一步行材料生物学性能的检测提供细胞来源。方法:取幼年SD大鼠骨髓,分离骨髓间充质干细胞,观察细胞形态特征、生长状况,从表面抗原表达及生物学行为两个方面进行鉴定。结果:我们采用的大鼠BMSCs分离及培养方法所获得的细胞纯度较高,生长性状稳定,增殖能力强。免疫细胞化学检测细胞表达CD44、CD54和CD71;CD34、CD45呈阴性表达。经过成骨条件培养基诱导分化后2周,细胞碱性磷酸酶染色阳性,3周后可以形成钙结节,证明所培养细胞可以向成骨细胞分化。结论:分离培养的细胞成分单一,鉴定为BMSCs,可以应用于材料生物学性能的检测。第三部分PLGA仿生矿化对大鼠BMSCs粘附增殖和成骨分化的影响目的:通过检测大鼠BMSCs在仿生矿化后PLGA表面粘附、增殖和成骨分化的行为,了解仿生矿化改性对PLGA生物学性能的影响,为进一步构建仿生矿化人工骨提供实验依据。方法:将培养的大鼠BMSCs分别接种于未矿化的PLGA和矿化后的PLGA上,同时以煅烧松质骨材料为对照,以间接计数法测定细胞接种24小时后的细胞粘附率;通过细胞DNA荧光定量检测法测定细胞在各组材料上增殖的情况,并绘制细胞增殖曲线;应用RT-PCR的方法测定各组材料上大鼠BMSCs成骨基因表达情况,通过比较成骨基因表达时间先后次序和量的变化,表明各组材料对BMSCs向成骨细胞分化的影响。结果:未矿化PLGA材料细胞粘附率为(36.7±5.4)%,矿化PLGA材料细胞粘附率为(66.2±8.9)%,煅烧松质骨材料细胞粘附率为(71.5%±6.4)%,未矿化组明显小于矿化组和煅烧松质骨组(p<0.05),矿化组和煅烧松质骨组的细胞粘附率没有明显差别(p>0.05)。BMSCs在三种材料上的生长曲线显示,煅烧松质骨组细胞数自接种后就开始快速增殖,10天后增殖速度变慢;矿化组细胞数在前6天缓慢增长,6天后细胞呈指数增长,第14天时细胞数和煅烧松质骨组没有明显区别;未矿化组细胞数在前6天没有明显变化,6天后缓慢增长直到14天,但总数仍明显少于矿化组和煅烧松质骨组。矿化组的细胞增殖速度明显高于未矿化组,但在早期低于煅烧松质骨组。大鼠BMSCs在三种材料上培养7天后,ALP相对表达水平松质骨组>矿化组>未矿化组,组间比较具有显著性差异(P<0.05);BSP和OCN在各组均没有表达。培养14天后ALP相对表达水平煅烧松质骨组和矿化组无显著性差别(P>0.05),但明显高于未矿化组(P<0.05);BSP在未矿化组无表达,煅烧松质骨组BSP相对表达水平明显高于矿化组(P<0.05);OCN在煅烧松质骨组有少量表达。培养21天后ALP相对表达水平未矿化组>矿化组>煅烧松质骨组,组间比较具有显著性差异(P<0.05);BSP相对表达水平显示矿化组和煅烧松质骨组没有明显差别(P>0.05),均明显高于未矿化组(P<0.05);OCN mRNA在未矿化组中没有表达,在矿化组和煅烧松质骨组有表达,OCN相对表达水平没有明显差别(P>0.05)。结论:PLGA经过仿生矿化表面改性后,能够显著提高材料促进大鼠BMSCs粘附、增殖以及成骨分化的能力。