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目前对于帕金森病(PD)的关注逐渐从运动障碍到非运动障碍,非运动型障碍中的认知障碍已经成为一个研究热点。细胞外调节蛋白激酶1(ERK1)属于MAPK家族,其通过参与调节多条与学习记忆相关的信号通路,对长时程突触增强(LTP)介导的学习记忆的形成具有重要的调节控制作用。骨髓间充质干细胞(BMSCs)已被证实其对移植治疗PD模型大鼠有较好的治疗效果。本实验研究帕金森病伴随的认知障碍的发生发展与ERK1表达变化的关系,并以转染ERK1基因的BMSCs(ERK1-BMSCs)移植治疗PD模型大鼠,探讨ERK1-BMSCs移植对PD认知障碍的治疗效果及其机制。1.帕金森病模型大鼠脑内ERK1的水平的研究采用立体定位、单侧脑纹状体内注射6-OHDA方法制备PD大鼠模型,以行为学实验(避暗箱实验、穿梭箱实验、Morris水迷宫实验)检测造模后2周、5周、8周成功模型大鼠的学习记忆能力,以免疫组织化学、Western blot(WB)及Q-PCR法检测ERK1在帕金森病实验大鼠脑内黑质纹状体中表达变化的规律。结果显示,造模2周开始旋转圈数逐渐增加,8周时增加至9.92±2.43 r/min;PD大鼠的明箱观察时间百分比显著低于正常对照组(94.96±2.62%v 99.22±1.40%;p<0.05,n=15);PD大鼠主动穿梭次数和平台象限时间均极显著低于正常对照组(p<0.01,n=15),且呈下降趋势。模型大鼠的脑黑质区ERK1阳性棕染细胞数均明显下降;模型大鼠脑纹状体内ERK1蛋白表达量均极显著低于对照组(p<0.01,n=5),且呈下降趋势;造模后2周大鼠脑纹状体内ERK1 mRNA相对表达量显著低于正常对照组(0.79±0.08 vs 1±0.07;p<0.05,n=5),造模5周和8周后相对表达量极显著低于正常对照组(p<0.01,n=5)。本实验提示,随病程的发展,PD模型大鼠的学习记忆能力明显下降,认知障碍的严重程度与PD病程加深呈正相关;认知障碍的发展与脑纹状体内ERK1的表达减少有密切关系。2.ERK1基因修饰BMSCs的构建利用Lipo 2000将构建的pCDNA3.1(+)-ERK1真核表达载体转染至BMSCs,获得ERK1-BMSCs。实验组分为ERK1-BMSCs组和BMSCs组。通过WB、Q-PCR、免疫细胞化学法检测两组的ERK1表达情况;在体外,利用β-巯基乙醇将ERK1-BMSCs定向诱导分化成神经元样细胞,探讨ERK1基因修饰后BMSCs的分化潜能及其分化后表达ERK1蛋白的能力。对重组载体的酶切电泳结果显示,酶切结果条带大小与理论值(1104 bp)一致。ERK1-BMSCs 中的 ERK1 蛋白表达量极显著高于 BMSCs(p<0.01,n=5);ERK1-BMSCs 中ERK1 mRNA 相对表达量极显著高于 BMSCs 组(5.40±0.13 vs 1±0.07;p<0.01,n=5)。ERK1-BMSCs经诱导分化后,神经元标志物生长蛋白Nestin和NSE蛋白表达呈阳性。结果提示转染ERK1基因不影响BMSCs的分化潜能,且ERK1-BMSCs诱导分化后仍能高表达ERK1蛋白。3.ERK1基因修饰的BMSCs移植治疗PD大鼠的研究将PD模型大鼠分为PBS对照组、BMSCs移植治疗组和ERK1-BMSCs移植治疗组3组,在3组动物的脑纹状体内分别定位注射PBS(10μL)、BMSCs(10μL,1×105个/μL细胞悬液)、ERK1-BMSCs(10μL,1×105个/μL细胞悬液)。各组大鼠在移植治疗后2周、5周、8周腹腔分别诱导转圈,并利用行为学实验检测各组治疗大鼠学习记忆能力的改变;并于上述时间点,取出大鼠纹状体组织,采用免疫组织化学法、WB技术以及Q-PCR方法检测各组治疗大鼠脑纹状体内ERK1的表达变化,分析对比各治疗组的治疗效果并探讨其作用机制。治疗2周后,ERK1-BMSCs组的转圈圈数极显著低于BMSCs组(5.08± 0.86 r/min vs 7.75士1.83 r/min,p<0.01,n=10);学习记忆检测结果显示,BMSCs和ERK1-BMSCs移植治疗后2周大鼠明箱观察时间、主动逃避次数均极显著多于PBS对照组(p<0.01,n=10)ERK1-BMSCs治疗8周主动逃避次数极显著多于BMSCs治疗组(p<0.01,n=10);BMSCs治疗2周后,平台象限时间显著多于PBS对照组(p<0.05,n=10),ERK1-BMSCs治疗2周平台象限时间显著多于 BMSCs 治疗组(p<0.05,n=10)。治疗后 2 周,ERK1-BMSCs 和 BMSCs 治疗组ERK1mRNA相对表达量分别为2.76±0.06、1.21±0.15,均极显著高于PBS对照组(p<0.01,n=5),ERK1-BMSCs组极显著高于BMSCs组(p<0.01,n=5);ERK1-BMSCs组和BMSCs组动物脑纹状体内ERK1阳性细胞数均随治疗时间逐渐增多(n=5);移植治疗2周、5周、8周后,ERK1-BMSCs组大鼠的ERK1蛋白表达量均极显著高于BMSCs组(p<0.01,n=5);与ERK1 mRNA表达结果相一致。实验结果提示,ERK1-BMSCs和BMSCs移植治疗PD模型大鼠后,大鼠的行为及学习记忆能力提高,PD及其认知障碍得到了改善,且ERK1-BMSCs移植治疗效果明显优于单独BMSCs移植治疗。