目的 多形胶质母细胞瘤(GBM)大约占所有已诊断脑肿瘤的三分之一。尽管应用各种治疗方法，包括手术切除，放疗和化疗，多形胶质母细胞瘤患者的预后仍极差，因此开发新的特异性的胶质瘤治疗方法成为当务之急。有临床应用前景的治疗方法包括基因疗法和免疫疗法。 对于肿瘤相关抗原的克隆和分析，以及对于可被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的肽片段的鉴定，为肿瘤的免疫治疗提供了新的可能性。近年来，研究者在开发肿瘤的免疫治疗方法方面进行了大量的努力，不论在体内还是在体外，均取得了令人鼓舞的结果。对于胶质瘤相关抗原如tenacin，gp240和EGFRvⅢ的克隆和鉴定，使有效的胶质瘤免疫治疗成为可能。EGFRvⅢ突变存在于60-70％的多形胶质母细胞瘤和胶质肉瘤中。这种突变型受体不存在于任何正常组织中，这使它成为胶质瘤免疫治疗的适宜靶点。随着从骨髓或外周血单核细胞(PBMC)中分离和培养树突状细胞(DC)方法的发展，应用装载有肿瘤相关抗原的同源树突状细胞进行免疫已经成为一种非常有前途的肿瘤免疫治疗方法。在抗肿瘤实验中，DC可以装载肽(肽疫苗)，肿瘤碎片或重组蛋白质，其中，研究最广泛的是肽疫苗。研究显示，应用装载有肽片段的DC进行免疫，可以产生针对多种人类肿瘤的肿瘤抗原特异性CTL。然而，开发肽疫苗的一个最主要的挑战就是鉴别可以用做肿瘤抗原特异性CTL靶点的肽片段。现在已确定的大多数肿瘤相关抗原的CTL结合肽均与HLA a*0201基因型相关，这种基因型是世界上大多数种族中主要的HLA亚型。因此，鉴定受HLA a*0201限制的恶性胶质瘤抗原相关的CTL结合肽，将在恶性胶质瘤的免疫治疗方面起十分重要的作用。另外，HLA a*0201转基因鼠已经建立，并被用来确定来源于肿瘤相关抗原的人CTL肽的免疫原性。综上所述，基因型为HLA a*0201的恶性胶质瘤细胞系对于鉴定CTL相关肽，以及在体内和体外评价恶性胶质瘤免疫治疗方法具有十分重要的意义。 因此，在本研究中，我们的第一个目的是：通过PCR-SSP和自动测序法鉴定几种基因型为HLA a＊020的恶性胶质瘤细胞系，并进一步证实这些新鉴定的 HLA a＊020胶质瘤细胞系是否可以用于开发恶性胶质瘤的免疫治疗方法。 近年来，研究者己经鉴定了许多可被肿瘤特异性CTL识别的肽片段，但其中大多数都与黑色素瘤特异性抗原如：ty。sinase，tyro sinase相关蛋白1和2，gP 00，MAGE－二和MAGE－3等相关。而起源于EGFRVlll，受MHC型分子怕 HLA a＊0201）限制的肽片段尚没有被鉴定。 因此，本研究的第二个目的是：鉴定受 HLA a＊020限定的胶质瘤特异性抗原EGFRVlll相关肽，并证实他们于体外诱导产生肿瘤特异性CTL的首力。 在过去的十年中，研究者分离得到许多肿瘤组织特异性启动子和增强子序列，并将他们用于恶性肿瘤的基因治疗。一种可能由胶质瘤特异性启动子调控的基因 （I－13 RaZ）最近从人肾癌细胞系中被克隆出来。许多证据显示IL－13Ra2在大多数人恶性胶质瘤中高表达。另外，IL－13RaZ基因在正常脑组织及人体其他正常器官中的表达微乎其微。人 IL－13 RaZ基因的这种特性使它成为蛋白质／肽为基础的疫苗或免疫毒素治疗的理想靶点。 尽管 IL八 Rail是一种重要的免疫调节分子和肿瘤治疗的靶分子，他在大多数胶质瘤发生发展中所起的作用仍不清楚，而且尚无人理解此基因表达的调节机制，对于调节此基因表达的顺式调节元件和反式作用因子的鉴定，将可以协助我们解释 IL－13 RaZ在人各种组织中的特殊表达方式，同时也可以使我们阐明此分子在免疫调节和肿瘤发生中的作用。 因此本研究的第三个目的是：克隆人 IL－13 RaZ基因启动子，并确定对此启动子功能起决定作用的调节区域。 恶性胶质瘤患者的不良预后使IL－13Ra2基因相关疗法的研究显得尤为重要。Mouse和rat是恶性胶质瘤临床前期实验最常用的两种动物模型。因此，我们应该了解与人IL－13RaZ基因相似的 mouse和 rat体内的相关基因。Donddson等已经克隆了叶ouse的几－13 RaZ基因。 因此本研究的第四个目的是：克隆 rat的 IL－13 Rail基因并检测此基因在rat各种组织中的表达情况。 ·2· 方 法 1．用 PC R－SSP和自动测序法进行基因型鉴定 2CR－5SP可以分辨H I－AI－A AZ和非H LALA AZ等位基因。H LALA AZ阳性标本的DNA扩增片段应用PCR纯化试剂盒纯化并送交AGACJaint Paal，MN）测序。根据HLA AZ外显子2和外显子3的共同序列设计测序引物。对于每一个HLA AZ DNA标本重复进行PCR—SSP和测序，以避免可能的错误结果。 2．免疫相关分子在恶性胶质瘤中的表达 应用流式细胞仪分析MHC小 微球蛋白，辅助刺激分子（CD80与CD86）以及Fas在恶性胶质瘤细胞表面的表达。对于每一种细胞系，流式细胞仪分析进行两次。 为了评价肽递呈相关基因在 HLA a＊020恶性胶质瘤细胞系中的表达，我们设计了TAP－1，TAP－2和Tapasin基因?