中性蛋白酶是最早用于工业生产的蛋白酶,在食品、生物和医药等方面得到广泛应用。本试验从自然发酵的霉豆瓣中分离筛选出一株高产中性蛋白酶的菌株米曲霉Y1,通过硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析两种纯化方法获得电泳级纯度的中性蛋白酶,研究发现常见金属离子能提高中性蛋白酶的酶活,其中以Cu²⁺激活效果最强,通过单因素试验筛选出Cu²⁺最适作用浓度,进一步探讨了添加Cu²⁺对中性蛋白酶酶学性质的影响,并探讨Cu²⁺对米曲霉Y1生长和产酶情况的影响。主要研究结果如下:（1）传统自然发酵的霉豆瓣作为本试验菌株的样品来源,试验共分离得到18株菌,有6株菌在中性酪蛋白培养基上产生透明圈,其中菌株Y1水解圈直径与菌落直径的比值最大,为2.54,其中性蛋白酶的酶活最高,为342.42U/mL。通过形态学对菌株Y1进行初步鉴定,采用18S rDNA片段扩增后进行序列测定,将序列测定结果与NCBI数据库进行同源性分析确定菌株Y1是米曲霉（Aspergillus oryzae）。（2）将米曲霉Y1接种到蚕豆培养基中,经过35℃培养48h后发酵成霉豆瓣,经过70%硫酸铵盐析,4℃透析48h除盐,DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析分离得到两个蛋白峰,分别测定两个蛋白峰的中性蛋白酶酶活,确定峰2为目的蛋白峰,峰2经过SDS-PAGE电泳显示为分子量约为45kDa的单一条带。整个纯化过程中性蛋白酶比酶活从226.94U/mg提高到2264.28U/mg,纯化倍数和回收率分别为10.0和21.0%。（3）米曲霉中性蛋白酶的最适反应pH值和最适反应温度分别是7.0和55℃,当pH值在7.0⁷.5时,中性蛋白酶较稳定,当温度在55℃时,经过55℃孵育30min后,中性蛋白酶酶活基本保持不变;四种蛋白酶抑制剂对米曲霉中性蛋白酶存在不同程度的抑制作用,Na⁺,K⁺,Fe²⁺,Ca²⁺,Sn²⁺,Pb²⁺,Al³⁺和Mn²⁺对其均有激活作用,其中Cu²⁺激活效果最显著,相对酶活提高了225.99%,Zn²⁺、Mn²⁺和Ba²⁺表现为抑制作用,米曲霉中性蛋白酶的米氏常数和最大反应速率分别为20.0769mg/mL和256.4103μg/mL·min。（4）添加0.2mM的Cu²⁺后,米曲霉中性蛋白酶的最适反应pH值和最适反应温度未发生改变,但酶活大小均有提高;中性蛋白酶的耐酸碱能力和耐热性都得到增强;四种抑制剂的抑制作用均有所降低,金属离子作用效果与空白组结果基本保持一致;相同条件下,其米氏常数和最大反应速率分别为14.0009mg/mL和649.3506μg/mL·min。（5）在35℃恒温培养条件下,空白组和Cu²⁺实验组在48h时孢子数量达到最大值,分别为6.63×10⁸CFU/g和8.77×10⁸CFU/g;在39h中性蛋白酶活达到最高值,分别为487.19U/mL和572.88U/mL。感官评分结果显示:在同一时间点Cu²⁺试验组分值均高于或等于空白组。综上,本试验从自然发酵霉豆瓣中筛选得到了一株高产中性蛋白酶的菌株Y1,经鉴定为米曲霉,使用两种纯化方法得到了电泳级纯度的中性蛋白酶,研究发现添加0.2mM的Cu²⁺能提高中性蛋白酶的酶活、耐酸碱耐高温的能力以及对底物酪蛋白的亲和力,并且能促进米曲霉孢子的萌发,提高中性蛋白酶的酶活。