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研究目的:Obg-likeATPase 1(OLA1)是一种GTP酶,属于TRAFAC(翻译因子相关)类,Obg-HfIX超家族中的YchF亚群,具有水解GTP和ATP的活性,结合核糖体调节蛋白质翻译,在细胞信号转导、胞内运输、细胞应激及胚胎发育中起着重要作用。本课题组前期研究表明OLA1缺失可以引起小鼠不全性围生期死亡,仅约20%Ola1-/-小鼠得以存活,而这些小鼠成年后表现为"个头小"。本研究拟进一步分析并寻找成年小鼠"个头小"的原因,并通过建立组织特异性敲除小鼠的模型以便研究OLA1在特定组织器官中的功能。研究内容和方法:采用基因捕获及Cre-loxP技术分别建立Ola1基因全身及组织特异性敲除的小鼠(Ola1-/-、AKO),以野生型小鼠(Ola1+/+)为对照,观察基础状态及饮食诱导下小鼠表型的变化。采用原代培养方法建立小鼠胚胎成纤维细胞系(MEF),并用反相蛋白芯片技术(Reverse Phase Protein Assay,RPPA)从中筛选与OLA1相互作用的蛋白。结合Ola1-/-小鼠表型以及RPPA结果,筛选出相关分子并于细胞、组织水平验证。随后,我们将对OLA1调节相关靶蛋白功能的分子机制进行初步的探索。研究结果:前期我们课题组已经报道了Ola1全身敲除小鼠表现为胚胎发育迟缓及围生期高致死率,表明OLA1在生长发育中的重要作用。通过对成年小鼠的进一步分析发现:相比于野生型小鼠,Ola1-/-小鼠仍表现为体型减小,各器官组织成比例减小,但脂肪组织减少更明显,尤其是白色脂肪组织,呈现明显"瘦"的表型。那么引起Ola1-/-小鼠白色脂肪组织减少的原因是OLA1影响了脂肪组织代谢,抑或是其他?于是我们从两个方面进行了验证。首先,我们采用Cre-loxp技术构建了Ola1基因脂肪组织特异性敲除(Adipose Tissue Specific Knockout,AKO)小鼠模型。与其对应野生型小鼠相比,在普通饮食及高脂饮食诱导下,AKO小鼠脂肪组织含量及相关代谢指标与野生型小鼠相比均无明显差异。这些结果表明OLA1不直接影响脂肪组织的代谢相关功能如脂肪组织新生,脂肪组织OLA1缺失不影响小鼠脂肪含量。另一方面,通过间接能量消耗测定、进食监测及小鼠认知行为相关实验,我们发现Ola1-/-小鼠能量消耗增加,进食减少,自主活动明显增加,认知记忆能力下降。据此,我们认为Ola1-/-小鼠脂肪组织含量减少的原因在于自主活动增加、进食减少所致的全身能量消耗增加。接着,我们利用RPPA技术比较了 Ola1+/+与Olal-/-MEF细胞中蛋白的差异性表达,发现GSK-3β的表达及活性在Ola1-/-MEF中明显增高。随后应用western blotting我们验证了在OLA1缺失或下调的细胞中及胚胎组织中GSK-3β蛋白水平及活性增高。同时IHC结果表明Ola1-/-小鼠的胚胎及成年脑组织中GSK-3β亦增高。Ola1-/-小鼠脑中GSK-3β表达及活性增高可以导致其自主活动增加,进食减少,使全身能量代谢失衡,作为能量储存载体的脂肪组织含量减少。随后我们以MEF细胞为基本工具,应用qRT-PCR、polysome profiling分别从转录水平、翻译水平研究了 OLA1对GSK-3β表达的调控,并结合放线菌酮追踪试验(CHX Chase Assay)评估OLA1对GSK-3β蛋白稳定性的影响,结果提示OLA1缺失后GSK-3β蛋白质稳定性增加进而引起蛋白水平上调。进一步,体外激酶抑制试验显示OLA1可以直接抑制GSK-3β的活性;免疫共沉淀结果表明OLA1和GSK-3β之间有直接的结合作用。综上所述,我们的研究首次阐明OLA1作为一种GTP酶,可以通过直接的相互作用促进GSK-3β的降解并抑制其活性。结论与创新1.在前期本课题组所报道的全身性Olaal基因敲除小鼠表型的基础上,本研究进一步发现了成年Ola1-/-小鼠的表型特征:作为能量存储载体的脂肪组织含量减少,呈现出明显"瘦"的体型。2.本研究成功构建了 floxed Ola1 E2小鼠品系(Ola1f/-),为研究Olal基因在特定组织器官背景下的功能提供了基础,并且构建了脂肪组织特异性敲除小鼠品系——AKO小鼠。AKO小鼠表现为正常的围生期存活率,没有生长发育迟缓。AKO小鼠在普通饮食和高脂饮食诱导后,均未表现出脂肪组织含量的变化。这些结果表明OLA1在脂肪组织相关代谢过程中没有直接的作用。3.本研究发现GSK-3β是OLA1作用的靶蛋白之一。OLA1可通过以下两种机制调节GSK-3β的活性:调节GSK-3β的稳定性影响其总蛋白水平;直接和GSK-3β相互作用抑制其激酶活性。通过阐明Ola1-/-小鼠脑中GSK-3β活性过度升高而导致其自发活动增加,进食减少,全身能量消耗增加,从而发现了 OLA1在机体能量代谢平衡中的间接作用。4.本研究进一步为OLA1在肿瘤中的研究提供了基础。GSK-3β参与许多信号通路如Wnt信号通路从而,而Wnt信号通路与多种肿瘤相关如结直肠癌等。因此,GSK-3β可作为桥梁为研究OLA1与其他相关肿瘤发生发展的关系奠定基础。