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目的:类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种常见的全身性自身免疫疾病,但其发病原因不明。其特征主要是慢性、对称性、进行性的多关节炎。由RA的慢性炎症导致的骨量丢失是最严重的的并发症之一。有研究表明,在新诊断的RA患者中,高达25%的患者在治疗前就已经发生了骨量流失,有11%的患者已发展为骨质疏松症。还有研究表明,骨量丢失与细胞因子具有密切的相关性。细胞因子调节着破骨细胞、成骨细胞和免疫系统细胞之间的相互作用,最终维持着骨代谢的平衡。白细胞介素（Interleukin,IL）-35是IL-12家族的新成员,由Epstein-Barr病毒诱导基因3（Epstein-Barr virus-inducible gene 3,Ebi3）亚基和p35（IL-12α）亚基组成。2007年,Vignali的研究组发现IL-35由调节性T细胞（regular T cells,Tregs）分泌并能抑制效应性T细胞的功能。我们课题组在之前研究中还发现,在小鼠胶原诱导性关节炎的成纤维样滑膜细胞中,IL-35可上调骨保护素（osteoprotegerin,OPG）,并下调核因子κB受体激活剂配体（receptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL）的表达,表明其在RA中具有潜在的骨保护作用。然而IL-35对RA骨量丢失的具体机制尚未明确,且研究甚少。为了更好的研究IL-35在RA骨量丢失中的作用,本研究将分析IL-35与RA患者骨量丢失相关指标的相关性,并进一步探讨IL-35对成骨细胞生物学功能的影响以及相关机制,为IL-35可能成为RA合并骨量丢失新的治疗靶点提供理论实验依据。研究方法:在第一部分的研究中,选取76名患有RA的绝经后妇女作为病例组和53名健康的绝经后妇女作为健康对照组。通过酶联免疫吸附测定法检测血清IL-35水平。使用双能X射线吸收测定法测量腰椎（L1-L4）和全髋骨的骨矿物质密度。通过免疫比浊法测定骨转换标志物,包括碱性磷酸酶（alkaline phosphates,ALP）,I型胶原羧基β端肽特殊序列（cross-linked C-terminal telopeptid of type I Collagen I,β-CTX）和25-（OH）VitD3。在第二部分研究中,选取小鼠前成骨细胞MC3T3E1细胞系为研究对象。拟用TNF-α刺激诱导MC3T3E1细胞系模拟成骨细胞在RA中的炎性环境。用CCK-8和流式细胞术检测IL-35对MC3T3E1细胞系增殖和凋亡的影响。用pNPP偶氮法检测ALP的活性。用RT-PCR和Western-blot检测MC3T3E1细胞中OPG和RANKL的表达水平。用茜素红染色检测MC3T3E1细胞系体外的矿化能力。在第三部分研究中,加入外源性Dkk-1阻断Wnt/β-catenin通路,探讨IL-35影响成骨细胞生物学功能的可能性机制。结果:在第一部分研究中:1.绝经后RA女性的血清IL-35水平高于健康对照组（P<0.0001）。2.与骨质减少和骨质疏松症患者相比,骨量正常的患者血清IL-35水平显著升高（分别为P<0.0001,P<0.0001）。3.血清IL-35水平与腰椎（L1-L4）骨密度（r=0.64,P<0.0001）和全髋关节骨密度为（r=0.43,P=0.0001）呈正相关。4.血清IL-35水平与β-CTX呈负相关（r=-0.35,P=0.0017）。血清IL-35水平与ALP无关（r=0.2,P=0.077）。但ALP组增加组的血清IL-35水平高于正常ALP组（P=0.0006）。5.血清IL-35水平与25（OH）VitD3呈正相关（r=0.37,P=0.0011）。6.在多因素线性回归模型中,IL-35在腰椎（L1-L4）和全髋的BMD中保持显著相关性（OR=0.463,P=0.026;OR=0.254,P=0.025）。在第二部分研究中:1.CCK-8结果显示,经过IL-35处理的第1天、第3天、第5天和第7天,与空白对照组比较（IL-35为0ng/mL）,IL-35促进MC3T3E1细胞的增殖（P<0.05）。在经过TNF-α诱导的MC3T3E1细胞中,IL-35也促进MC3T3E1细胞的增殖（P<0.05）,说明IL-35对MC3T3E1和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的增殖具有促进作用。2.流式细胞术结果显示,经过不同浓度的IL-35（25、50、100ng/mL）处理后,与空白对照组比较（IL-35为0ng/mL）,MC3T3E1细胞的凋亡降低（P<0.05）,说明IL-35对MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的凋亡具有抑制作用。3.pNPP偶氮法结果显示,在MC3T3E1细胞系和经过TNF-α诱导的MC3T3E1细胞中,经过第3天、第5天、第7天和第9天,经过IL-35（50ng/mL）处理后,与空白对照组比较（IL-35为0ng/mL）,MC3T3E1细胞的ALP活性显著增强（P<0.05）,说明IL-35促进MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的ALP的活性。4.RT-PCR和Western-blot结果显示,MC3T3E1和经过TNF-α诱导的MC3T3E1细胞中,与空白组（IL-35为0ng/mL）比较,IL-35显著升高OPG的表达（P<0.05）,显著降低RANKL的表达（P<0.05）。另外,我们的研究还发现,经过TNF-α诱导的MC3T3E1细胞的OPG、RANKL的表达比未经TNF-α处理的MC3T3E1细胞的OPG、RANKL的表达也是显著升高的（P<0.05）。5.茜素红染色结果显示,在MC3T3E1和经过TNF-α诱导的MC3T3E1细胞中,经过矿化液诱导的第20天,与空白对照组比较（IL-35为0ng/mL）,MC3T3E1细胞的体外矿化能力显著增强（P<0.05）,说明IL-35对MC3T3E1细胞系的体外矿化能力具有促进作用。在第三部分研究中:1.加入外源性Dkk-1后,IL-35诱导的MC3T3E1细胞增殖显著下降（P<0.05）。2.IL-35诱导的MC3T3E1的细胞凋亡显著升高（P<0.05）。3.IL-35诱导的ALP活性显著下降（P<0.05）。4.体外矿化能力也显著下降（P<0.05）。5.MC3T3E1细胞表达的OPG和RANKL也显著下调（P<0.05）。结论:在第一部分研究中:血清IL-35水平与绝经后RA患者的BMD,骨代谢指标和维生素D水平相关,提示IL-35在RA骨丢失的发生发展中具有重要的作用。在第二部分研究中:1.IL-35促进MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的增殖。2.IL-35抑制MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的凋亡。3.IL-35增加MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的ALP活性。4.IL-35增加MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系OPG mRNA和蛋白的表达,降低RANKL mRNA和蛋白的表达。5.IL-35促进MC3T3E1细胞系和TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系体外矿化的能力。在第三部分研究中:1.IL-35通过Wnt/β-catenin途径促进TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的增殖。2.IL-35通过Wnt/β-catenin途径抑制TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的凋亡。3.IL-35通过Wnt/β-catenin途径促进TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的ALP活性。4.IL-35通过Wnt/β-catenin途径促进TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系外矿化能力。5.IL-35通过Wnt/β-catenin途径上调TNF-α诱导的MC3T3E1细胞系的OPG表达,同时下调RANKL的表达。