研究背景支气管哮喘(bronchial asthma,简称哮喘)是一种异质性疾病,其基本病理特征是气道炎症及气道重塑。其中气道重塑是导致哮喘患者肺功能快速下降及固定性气流受限的主要原因,同时5-10%的重症哮喘表型与气道重塑显著相关。而目前哮喘的治疗,包括靶向治疗在内,主要针对细胞因子与炎症介质,尤其是Th2细胞水平增高的哮喘表型,目前的哮喘规范治疗,只能使78%的哮喘患者达到临床控制。气道重塑是其他哮喘患者未达到临床控制的重要原因之一。因此,针对哮喘气道重塑机制及靶向干预的研究对于哮喘,尤其是难治性哮喘患者来说是十分必要的。上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)可发生在多种与组织重塑相关的慢性气道疾病中,EMT是指上皮细胞紧密链接及粘附链接等上皮性状及上皮细胞标记物等的丧失,同时获得间质细胞的特性及间质标记物表达增多。有学者认为气道重塑可能是因为EMT过程而加重了上皮下纤维化。FSTLl(follistatin-like1,卵泡抑素样蛋白1)是一种分泌性糖蛋白,对于肺部器官的形成及发育具有重要作用。值得注意的是近来FSTL1在组织修复或重构中的作用受到研究者的极大关注。Sonomi Maruyama等发现FSTL1在心脏缺血后心肌重构修复过程中具有重要作用。在心肌梗塞的小鼠模型中,FSTL1在纤维母细胞及肌纤维母细胞中高表达,并通过激活ERK信号通路促进纤维母细胞的增殖及迁移。而在条件性敲除FSTL1的心肌梗塞小鼠模型中,缺血组织中的Ⅰ型胶原(collagenⅠ)和纤连蛋白(fibronectin)的蛋白表达量均降低。另外,FSTL1也参与了肺部组织的纤维化过程,在Fstl1+/-小鼠或采用中和抗体阻断FSTIL1均可减轻博来霉素介导的小鼠肺纤维化。同时有研究表明盘状蛋白2同形体A(disco inter-acting protein 2 homolog A,DIP2A)可能作为 FSTL1 的受体,介导FSTL1的下游作用。细胞自噬是一种高度保守的存在于真核细胞内的溶酶体依赖的降解途径。其通过单层或双层膜包裹待降解物形成自噬体,然后运送到溶酶体形成自噬溶酶体,降解其包裹的内容物,以实现细胞本身的代谢需要和细胞器的更新,以及细胞的生长发育及细胞内稳态的维持。自噬可参与多种生物学过程并且在疾病进展中可发挥不同生物学作用。有研究发现自噬可能参与了哮喘的发病过程,并在哮喘患者的气道活检组织中发现了增多的自噬小体,同时发现自噬与一秒用力呼气量(Forced Expiratory Volume in1 second,FEV1)的降低相关。另外,研究发现细胞自噬相关基因(Autophagy-related gene,ATG)位点的核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)与哮喘的发生相关。以上证据提示,FSTL1及细胞自噬可能在哮喘气道重塑过程中发挥重要作用,然而FSTL1与细胞自噬之间的相互关系及二者如何介导气道重塑未见相关报道,针对以上问题,本课题主要针对FSTL1及细胞自噬介导哮喘气道重塑的作用机制进行研究,以期寻找其中可利用的阻断靶点,为临床有效干预气道重塑的进展过程提供依据。研究目的探究FSTL1与细胞自噬介导哮喘气道重塑的具体机制,发现可能阻断上述通路进而减轻哮喘气道重塑的有效作用靶点。研究方法1.哮喘患者气道上皮细胞自噬及FSTL1的表达1.1病例选择选取2015-2016年就诊于山东大学齐鲁医院呼吸科的哮喘病人7例,行支气管镜检查,获取气道组织标本。对照组气道组织标本(7例)来源于山东大学齐鲁医院器官捐献中心。1.2 H&E(hematoxylin&eosin)染色观察气道黏膜组织基本病理表现。1.3 Masson’s trichrome染色观察气道粘膜组织胶原纤维表达情况。1.4免疫组织化学分别检测气道FSTL1、beclinl、EMT标记物E-Cadherin、N-Cadherin、vimenin以及气道重塑标记物fibronectin、α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达情况。1.5免疫荧光检测FSTL1、E-Cadherin的共表达情况。1.6透射电子显微镜观察气道黏膜组织中自噬小体。2.FSTL1通过DIP2A受体增强上皮细胞自噬进而促进EMT的机制研究2.1 小干扰 RNA(small interfering RNA,si-RNA)转染:运用 Lipofectamine 3000转染试剂,向人气道上皮细胞系16HBE细胞(Human Bronchial Epithelial Cells)转染si-RNA(si-DIP2A、si-ATG5、si-NC)。此部分实验分组情况如下:对照组,FSTL1 刺激组(FSTL1 100 ng/ml),si-NC 对照组(转染 si-NC),si-DIP2A 组(转染 si-DIP2A),FSTL1+si-NC 组,FSTL1+si-DIP2A 组。2.2 16HBE细胞的刺激及抑制剂处理分组:对照组,FSTL1刺激组(FSTL1 100ng/ml),LY-294002 刺激组(LY-294002 10uM),FSTL1+LY-294002 组(FSTIL1 100ng/ml+LY-294002 10uM)。2.3 FSTL1及阻断其受体DIP2A对气道上皮细胞EMT的影响:给予16HBE细胞FSTL1刺激及转染siRNA干扰受体DIP2A的表达后,Western blot方法检测上皮标记物E-Cadherin、间质标记物N-Cadherin、vimentin、collagen I及α-SMA的表达,同时采用transwell迁移实验观察FSTL1刺激及si-DIP2A对细胞迁移能力的影响。2.4自噬抑制剂对FSTL1介导的上皮细胞自噬及EMT的影响:采用人气道上皮细胞系16HBE细胞,给与FSTL1刺激及LY-294002作用后,采用透射电子显微镜观察细胞自噬小体的表达情况;另外,将16HBE细胞进行GFP-LC3慢病毒转染后,给予16HBE细胞FSTL1刺激及LY-294002作用,在倒置荧光显微镜下观察LC3B颗粒状聚集情况,以明确细胞自噬水平的高低;同时western blot检测细胞自噬标记物beclin1的表达水平及LC3BⅡ/LC3B Ⅰ表达水平。同时western blot检测上皮标记物E-Cadherin、间质标记物 N-Cadherin、vimentin、collagen Ⅰ 及 α-SMA 的表达,明确 FSTL1及LY-294002对于细胞EMT标记物蛋白表达水平的影响;细胞免疫荧光检测 E-Cadherin、N-Cadherin、vimentin 的定位表达;另外,通过 transwell 实验、细胞胶原凝胶收缩实验检测FSTL1及LY-294002对细胞迁移能力及收缩能力的影响。2.5敲除自噬相关基因ATG5对FSTL1介导的上皮细胞EMT的影响:给予16HBE细胞FSTL1刺激及转染siRNA干扰自噬相关基因ATG5的表达后,Western blot方法检测上皮标记物E-Cadherin、间质标记物N-Cadherin、vimentin、collagen Ⅰ 及 α-SMA 的表达。3.体内阻断FSTL1及自噬对于哮喘小鼠气道EMT和重塑的影响3.1实验动物分型:①C57BL/6野生型(wide type,WT)小鼠;②Fstl1flox/+小鼠;③cmv-Cre小鼠;④Fstl1+/-小鼠:Fstl1fox/x小鼠与cmv-Cre小鼠交配,通过对后代小鼠进行基因型检测,获得Fstl1+/-小鼠。3.2实验动物造模:①采用ovalbumin(OVA)致敏加激发的方法。方法如下:致敏阶段小鼠分别于第0天、14天腹腔注射100ugOVA加氢氧化铝2mg,一起溶于 200ul磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)中;激发阶段采用滴鼻方式(200ugOVA溶于20ul PBS中),分别于第21、23、25天及第28天后每周两次滴鼻激发,连续4周;②FSTL1及FSTL1+LY-294002干预小鼠模型:A、FSTL1干预:采用1OugFSTL1(溶于50u1PBS中)滴鼻干预的方式,每天1次,连续干预15天;B、LY-294002干预:在FSTL1干预之前2h,腹腔注射LY-294002(给药剂量与小鼠体重相关,按7.5mg/kg给药)。对照组小鼠采用相同给药方式给与相同体积的PBS。3.3实验动物分组:对照-WT组,OVA-WT组;OVA-Fstl1flox/+组,OVA-Fstk1+/-组;FSTL1-WT组,FSTIL1+LY-294002-WT组。3.4小鼠肺功能检测各组小鼠气道反应性情况。3.5 H&E、PAS(PeriodicAcid-Schiff)染色检测小鼠气道基本病理表现。3.6 酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠血浆及肺泡灌洗液中FSTL1的表达水平。3.7透射电子显微镜观察小鼠气道黏膜组织自噬小体表达情情况。3.8 免疫组织化学检测小鼠气道 FSTL1、beclin、E-Cadherin、N-Cadherin、vimentin、fibronectin、α-SMA 的表达情况。结果1.哮喘患者气道重塑程度升高,并伴有上皮细胞自噬及FSTL1的表达升高。1.1哮喘组病人与对照组年龄上无统计学差异,性别构成相同。哮喘组患者气道黏膜呈现上皮完整性破坏、上皮下基底膜明显增厚、杯状细胞增生等气道重塑表现。Trichrome染色发现哮喘组患者气道组织中胶原纤维明显增多。1.2免疫组化结果显示哮喘患者气道黏膜组织中FSTL1高表达,同时伴随上皮标记物E-Cadherin表达降低、间质标记物N-Cadherin、vimentin及重塑标记物fibronectin、α-SMA的表达增高;采用免疫荧光方法对FSTL1及E-Cadherin双染,进一步明确FSTL1在哮喘患者气道内的定位表达,发现与对照组相比,FSTL1除在间质高表达外,还可表达于哮喘患者的气道上皮细胞,而哮喘患者气道上皮细胞内的E-Cadherin表达则减少。1.3哮喘组患者气道上皮自噬标记物beclin1表达水平增高;同时,运用电子透射显微镜观察气道粘膜组织,发现哮喘组患者气道黏膜上皮细胞内有大量的自噬小体。2.FSTL1通过DIP2A受体增强16HBE上皮细胞自噬水平进而促进EMT2.1 FSTL1介导气道上皮细胞EMT标记物表达变化。FSTL1可刺激上皮细胞间质标记物N-Cadherin、vimentin及重塑标记物collagen I、α-SMA表达增多,并介导E-Cadherin表达减少,并且呈时间浓度依赖性。2.2 FSTL1通过DIP2A介导气道上皮细胞EMT变化。通过siRNA阻断DIP2A的表达,可发现si-DIP2A可减弱FSTL1介导的16HBE细胞间质标记物N-Cadherin、vimentin及重塑标记物collagen I、α-SMA的表达增多,并抑制E-Cadherin的表达减少(P<0.05),同时阻断DIP2A后,通过transwell迁移实验发现细胞的迁移能力也降低(P<0.05)。2.3 FSTL1可促进上皮细胞自噬。FSTL1刺激16HBE细胞后,细胞内自噬小体数量较对照组明显增加;同时稳定转染GFP-LC3B的16HBE细胞在给予FSTL1刺激后,细胞内LC3B颗粒状聚集现象明显,自噬标记物beclin1及LC3BⅡ/LC3B Ⅰ表达增多(P<0.05)。而给予自噬抑制剂LY-294002后,LY-294002可抑制FSTL1介导的自噬小体增多及GFP-LC3B在细胞内的聚集(P<0.05),同时LY-294002可降低FSTL1介导的细胞自噬标记物beclin1的表达水平及LC3BⅡ/LC3B Ⅰ达水平的比值降低(P<0.05)。2.4抑制细胞自噬可降低FSTL1介导的上皮细胞EMT。LY-294002作用后,细胞内的EMT上皮标记物E-Cadherin表达上调、间质标记物N-Cadherin、vimentin表达下调,重塑标记物collagen Ⅰ、α-SMA表达亦下调(P<0.05)。Transwell实验结果显示与FSTL1单纯刺激组相比,FSTL1+LY-294002组细胞的迁移能力下调(P<0.05);同时通过胶原凝胶收缩实验,观察到LY 294002同时还抑制了 FSTL1介导的细胞收缩水平的下调(P<0.05)。另外,通过si-ATG5干扰自噬后,亦发现细胞内的EMT上皮标记物E-Cadherin表达上调、间质标记物N-Cadherin、vimentin表达下调,重塑标记物collagenⅠ、α-SMA表达亦下调(P<0.05)。3.体内阻断FSTL1及自噬对于哮喘小鼠气道EMT和重塑的影响3.1 FSTL1在OVA哮喘小鼠模型血浆及肺泡灌洗液中高表达。3.2 OVA哮喘小鼠模型中自噬水平增强,同时伴随EMT及气道重塑水平增强。3.3 OVA介导的Fstl1+/-基因敲除小鼠自噬水平降低,同时伴随EMT及气道重塑程度降低。3.4 FSTL1刺激小鼠可介导小鼠气道自噬水平增强及气道EMT、重塑和高反应性,阻断自噬可减轻FSTL1介导的气道EMT、重塑及高反应性。3.5 FSTL1可介导小鼠气道反应性增高,阻断FSTL1及自噬均可降低小鼠气道反应性。结论1.哮喘患者气道粘膜组织存在重塑表现,并且伴随气道上皮细胞FSTL1表达增多及上皮细胞内自噬水平增高。2.体外实验中,FSTL1可通过DIP2A受体介导气道上皮细胞自噬进而促进上皮细胞EMT。3.动物实验中,Fstl1+/-敲除及LY-294002干预细胞自噬均可降低气道EMT及重塑表现。