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草鱼是我国最受欢迎的淡水鱼之一,居大众消费鱼类之首。草鱼加工过程中会产生许多下脚料,包括鱼皮在内都富含胶原蛋白,是制备生物活性肽的良好原料。采用蛋白酶酶解技术对草鱼皮进行酶解,所得酶解液中含有多种活性多肽,具有降血压及抗氧化等生物活性,不仅能解决优质蛋白资源浪费的问题,还能为功能性食品的开发和医药行业提供可靠的原料。本文以草鱼皮为研究对象,提取胶原蛋白并进行性质分析,同时,比较不同蛋白酶对草鱼皮蛋白酶解液抗氧化能力的影响;优化碱性蛋白酶酶解液制备工艺;分离纯化蛋白酶解液中的有效抗氧化成分;最后采用测序技术对分离得到的抗氧化肽进行一级结构鉴定,通过体外抗氧化实验评估抗氧化能力,初步探索抗氧化活性和多肽结构之间的关系。主要研究结论如下:(1)草鱼皮中蛋白质含量高达31.31%(以湿基计),富含甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和脯氨酸(Pro),同时含有七种人体必需氨基酸,属于优质蛋白。分别利用冰醋酸和胃蛋白酶从草鱼皮中提取胶原蛋白,并命名为酸溶性胶原蛋白(ASC)和酶溶性胶原蛋白(PSC),ASC和PSC得率分别为8.9%和17.8%(湿重),利用紫外光谱扫描对胶原蛋白进行定性分析,通过红外光谱中特有基团振动说明胶原蛋白二级结构完整,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实ASC和PSC均为I型胶原蛋白,并说明了两者在组成上有一定差异,采用电镜扫描观察两种胶原蛋白的形态差异,ASC呈紊乱的多孔纤维束状,PSC呈有序排列的纤维丝状,最后构造两种体系比较ASC和PSC的溶解性能,发现PSC在不同NaCl浓度和不同pH体系中,溶解效果均好于ASC。(2)分别采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和胃蛋白酶对草鱼皮蛋白进行酶解,并测定其水解度、多肽含量和抗氧化活性。以DPPH自由基清除率为主要筛选指标,选择碱性蛋白酶作为最佳的草鱼皮蛋白水解酶。根据单因素试验结果,选取四因素三水平,以DPPH自由基清除率为指标通过响应面设计试验,确定了碱性蛋白酶水解草鱼皮最佳条件:加酶量6.3%、料水比1:40.6、酶解温度51.3℃□、酶解时间115.1 min,此时DPPH自由基清除率最高为54.09%,而在此工艺条件下进行平行验证得到清除率为54.98%,水解度为13.55%。(3)以DPPH自由基清除率为指标,分离纯化草鱼皮碱性蛋白酶解液(GPH)中的抗氧化肽。采用葡聚糖凝胶柱G-15分离GPH得到五种组分(A、B、C、D、E),其中组分E的DPPH自由基清除率最高,因此,选取该组分进行反相高效液相色谱纯化分析,得到E1、E2、E3、E4和E5五个主要峰,再对E2进行二次纯化得到两个峰E21和E22,最终对所有分离峰的DPPH自由基清除能力进行对比分析发现E21、E4和E5三个分离峰抗氧化能力较强,进一步对抗氧化能力较强的三个峰E21、E4、E5进行结构分析。经鉴定GPH-E21、GPH-E4和GPH-E5的一级序列结构和相对分子量分别为:Pro-Tyr-Ser-Phe-Lys(PYSFK,640.54 u)、Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Leu(GFGPEL,618.50 u)和Val-Gly-Gly-Arg-Pro(VGGRP,484.11 u)。(4)采用体外抗氧化实验综合评估抗氧化肽的能力,三种抗氧化肽均表现出浓度依赖性,当抗氧化肽浓度升高时,其抗氧化能力也相应增强,其中GPH-E21、GPH-E4和GPH-E5清除DPPH自由基的半抑制浓度ICso分别为2.459、3.634和6.063 mM;清除羟基自由基的IC50分别为3.563、2.606和4.241mM;清除ABTS自由基的IC50分别为0.281、0.530和0.960 mM;三种抗氧化肽均能有效抑制亚油酸的过氧化,其中GPH-E5表现出明显的抑制效果,其效果类似于L-型谷胱甘肽,而GPH-E4和GPH-E5次之。