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信号素3A(Semaphorin3A,Sema3A),最初认为是神经系统发育和轴突导向的负向调控蛋白。近年来研究表明,Sema3A在内皮细胞、骨髓细胞、肿瘤细胞等多种细胞中低表达,在肿瘤发生和血管生成的研究中日益受到关注。然而,其对肿瘤血管生成的具体调控机制尚未得到充分解释。本研究发现,Sema3A在胃癌患者组织、血清及多种人胃癌细胞系中均低表达,其受体神经激肽-1(Neuropilin-1,NRP-1)在胃癌患者组织、人胃癌细胞MKN-28中高表达,并且Sema3A与胃癌组织的微血管密度(Microvessel density,MVD)呈负相关。提示Sema3A可能参与并负向调控胃癌血管生成的发生发展过程。因此,本研究假设外源性加入重组人Sema3A能够抑制胃癌血管生成,从而逆转肿瘤发展进程。为了验证这一假设,我们建立了“胃癌细胞-人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)”体外共培养体系,模拟人体内胃癌血管生成微环境。外源性加入重组人Sema3A后,发现HUVEC的小管形成能力和血管内皮生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)蛋白表达显著下降,而NRP-1蛋白表达水平无明显变化。实验结果提示,Sema3A可能通过下调VEGFR2的表达,抑制VEGF诱导的肿瘤血管生成,从而起到抑制胃癌生长和转移的作用。因此,在实施抗VEGF胃癌治疗方案时,外源性加入Sema3A蛋白可能起到抑制胃癌血管生成的作用,可能为胃癌的临床治疗提供新的思路。目的:研究Sema3A及其受体NRP-1在胃癌中的表达及Sema3A与微血管密度的相关性,探讨重组人Sema3A对胃癌血管生成的影响及其相关的机制。方法:1.免疫组织化学SP法检测Sema3A及其受体NRP-1在胃癌组织和正常胃黏膜中的表达情况,以及胃癌组织中的微血管密度。2.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胃癌患者血清中Sema3A蛋白的分泌水平。3.蛋白印迹法(Western blotting)检测正常胃粘膜细胞(GES-1)和五株胃癌细胞系(MGC-803、HGC-27、MKN-28、SGC-7901、MKN-45)中Sema3A及其受体NRP-1的蛋白表达情况。4.建立“正常胃粘膜细胞-人脐静脉内皮细胞”和“胃癌细胞-人脐静脉内皮细胞”体外共培养体系,分别模拟人体内正常和胃癌血管生成微环境。在共培养体系中外源性加入重组人Sema3A蛋白,通过小管形成(Tube formation)实验,检测不同浓度重组人Sema3A对共培养体系中HUVEC成管能力的影响。5.蛋白印迹法检测不同浓度重组人Sema3A对共培养体系中HUVEC的NRP-1和VEGFR2蛋白表达水平的影响。结果:1.Sema3A及其受体NRP-1在胃癌组织的表达与定位情况免疫组化结果显示,Sema3A在胃癌组织中的表达显著低于正常胃粘膜组织(P<0.001),主要定位于细胞质中;NRP-1在胃癌组织中的表达明显高于正常胃粘膜组织(P<0.001),主要定位于细胞膜和细胞质。Sema3A与NRP-1二者之间的表达无显著相关性(P=0.963)。2.Sema3A及其受体NRP-1与临床病理特征的关系临床病理特征分析结果表明,Sema3A及其受体NRP-1与胃癌TNM分期相关,Ⅲ期患者胃癌组织中Sema3A的阳性表达率明显低于Ⅰ、Ⅱ期(P=0.037),Ⅲ期患者胃癌组织中NRP-1的阳性表达率较Ⅰ、Ⅱ期明显升高(P=0.026)。Sema3A和NRP-1的表达与患者年龄、性别、肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移均无相关性(P>0.05)。3.Sema3A蛋白在胃癌患者血清中的分泌水平ELISA结果显示,Sema3A在胃癌患者血清中的分泌水平明显低于正常对照组(P<0.001)。4.胃癌组织中Sema3A表达水平与微血管密度的相关性分析MVD计数分析显示,胃癌组织中Sema3A的阳性表达率与MVD值呈负相关(P<0.001)。5.Sema3A及其受体NRP-1在人胃癌细胞系和正常胃粘膜细胞中的表达情况蛋白印迹实验结果显示,四株人胃癌细胞系HGC-27、MKN-28、SGC-7901、MKN-45中Sema3A的表达水平低于正常胃粘膜细胞GES-1(P<0.05),其中MKN-28细胞中Sema3A的表达量最低。NRP-1在MKN-28人胃癌细胞中的表达水平高于正常胃粘膜细胞(P=0.007)。6.体外共培养体系中HUVEC成管能力的比较构建共培养体系分别模拟人体内正常(GES-1+HUVEC)和胃癌(MKN-28+HUVEC)血管生成微环境。体外小管形成实验结果显示,MKN-28+HUVEC共培养体系中HUVEC的成管能力明显高于正常组(P<0.001)。同时ELISA结果表明,MKN-28+HUVEC共培养体系中Sema3A的分泌水平显著低于正常组(P<0.001)。7.MKN-28+HUVEC共培养体系中,不同浓度重组人Sema3A对HUVEC成管能力的影响小管形成实验结果显示,外源性加入重组人Sema3A后,MKN-28+HUVEC共培养体系HUVEC形成的小管数量、长度明显减少,管腔结构的完整性也明显降低,且HUVEC的成管能力随着重组人Sema3A浓度的升高而减弱(P<0.05)。8.MKN-28+HUVEC共培养体系中,不同浓度重组人Sema3A对HUVEC的VEGFR2、NRP-1蛋白表达水平的影响蛋白印迹实验表明,MKN-28+HUVEC共培养体系中加入重组人Sema3A后,VEGFR2的蛋白表达水平明显降低,且具有浓度依赖性(P<0.01),而对NRP-1的蛋白表达无明显影响。结论:1.Sema3A在胃癌组织、患者血清和胃癌细胞系中均低表达,NRP-1在胃癌组织、MKN-28细胞中高表达。2.Sema3A及其受体NRP-1均与胃癌患者TNM分期相关,Sema3A与微血管密度负性相关。3.重组人Sema3A具有体外抑制胃癌血管生成的作用,可能与下调VEGFR2蛋白表达有关。