研究背景组蛋白H3K4去甲基化酶RB-binding protein 2(RBP2)作为表观遗传调控分子在癌症发生发展中起重要作用。本课题组研究证实RBP2在胃癌发生中起关键调控作用,参与胃癌细胞衰老、增殖、侵袭转移等多个过程。细胞物质及能量代谢在肿瘤发生发展中的意义一直备受关注,但RBP2在胃癌发生过程中通过调控代谢关键酶影响细胞糖、脂代谢的分子机制及生物学意义目前尚不明确。过氧化物酶体增殖物活化受体丫(Peroxisome Proliferator-Activated Receptorγ,PPARγ)作为细胞代谢重要调控分子,已被证明参与肿瘤的增殖、凋亡等过程。研究预测RBP2可调控PPARy表达。因此,研究胃癌关键表观遗传调控分子RBP2通过调控PPARy影响糖、脂代谢中关键酶的活性,导致肿瘤细胞代谢异常的作用机制,对于在表观遗传水平探究肿瘤细胞物质、能量代谢的分子调控机制及对肿瘤发生的影响十分重要。研究目的研究胃癌关键表观遗传调控分子RBP2通过调控PPARγ参与胃癌细胞代谢的分子作用机制和生物学效应。研究方法1、人体胃癌组织标本水平利用生物信息学技术,结合数据库分析RBP2和PPARγ在人体胃癌组织的表达情况以及两者之间的相关性,以及PPARγ对胃癌预后的影响。通过免疫组化和qRT-PCR法进一步在16对胃癌组织和对应的癌旁正常组织中分别检测RBP2和PPARγ在人体标本中mRNA和蛋白水平表达的情况及表达相关性。2、分子和细胞水平利用qRT-PCR和Western blotting方法验证PPARy在四种胃黏膜上皮细胞来源的细胞系GES-1、AGS、BGC-823、SGC-7901中的本底表达。转染RBP2表达质粒或特异小干扰RNA分别使RBP2过表达或抑制表达后,通过qRT-PCR和Western blotting法验证RBP2对PPARγ及下游糖酵解、脂代谢调控分子PKM2、PFKFB3、FASN、CPT1A的表达影响;利用荧光发光法和化学发光法分别检测在此过程中细胞ATP生成量和LDH活性变化。与此同时,在细胞中分别转染PPARγ表达质粒和特异小干扰RNA使PPARy过表达或抑制表达,检测其对下游代谢调控分子表达的影响及生物学效应。双荧光素酶活性检测实验确定RBP2对PPARγ启动子的直接调控作用。回复实验证实PPARγ在RBP2影响糖脂代谢关键调控分子及ATP生成和LDH活性中的重要作用。3、实验动物模型水平利用特异干扰RBP2表达的BGC-823细胞进行裸鼠皮下成瘤实验;在此过程中观察成瘤情况;利用qRT-PCR、Western blotting和免疫组化等方法检测形成的肿瘤中RBP2、PPARγ、PKM2、PFKFB3、FASN、CPT1A的表达情况及相关性,在体内进一步验证RBP2通过调控PPARγ对肿瘤细胞代谢的影响及其在胃癌发生中的重要作用。研究结果1、人体胃癌组织标本水平生物信息学分析、qRT-PCR和免疫组化检测结果均证实:RBP2和PPARy在人体胃癌组织中高表达,两者间的表达存在正相关关系;PPARγ与胃癌患者的预后呈负相关。2、分子和细胞水平在四种胃黏膜上皮细胞来源的细胞系中,PPARγ均稳定表达。RBP2高表达可使PPARγ表达升高,导致糖酵解关键调控分子PKM2、PFKFB3和脂肪酸合成酶FASN表达上升,而脂肪酸氧化分解限速酶CPT1A则表达下降,从而使细胞ATP生成和LDH活性有所上升;RBP2表达受到抑制后,PPAR γ表达下降,糖酵解关键调控分子和FASN表达下降,CPT1A表达有所上升,细胞ATP生成和LDH活性有所下降。在细胞中直接高表达PPAR γ或特异性抑制PPARγ表达可得到一致性的结果。双荧光素酶活性检测实验证实RBP2可以直接结合PPAR丫启动子区激活其活性。回复实验表明PPARγ在RBP2调控糖、脂代谢关键分子及细胞ATP生成量和LDH活性中是必需的。3、实验动物模型水平干扰RBP2后,胃癌细胞在裸鼠皮下的成瘤能力下降,生长受到抑制;PPAR γ和糖酵解及脂肪酸合成相关调控分子的mRNA和蛋白水平的表达也同时下降,脂肪酸氧化分解相关调控分子表达则有所上升。结论在人体胃癌组织标本中,RBP2和PPARγ均高表达且呈正相关;PPARγ的表达与胃癌预后呈负相关。RBP2可以通过直接调控PPAR γ启动子活性,促进其表达,从而调控细胞糖、脂代谢相关关键分子,促进糖酵解和脂肪酸合成,抑制脂肪酸氧化分解,使细胞ATP生成和LDH活性有所增加,促进胃癌发生。本研究通过探讨表观遗传分子RBP2调控PPARγ在肿瘤代谢中的重要作用及分子调控机制,为胃癌的早期诊断和治疗提供了一定的理论依据。