载体构建是分子生物学研究中的基础和重要环节。在各种载体构建的方法中，Golden Gate技术是一种新近发展的快速克隆技术，它利用Ⅱ s类型的限制性内切酶在识别位点外切割的特点，使酶切和连接能在一管内同步完成，并且能同时连接多个DNA片段。基于Golden Gate技术，本论文创建了一种用于质粒载体改造和构建的新方法，同时还对2类特定载体(—)植物RNA干扰(RNAi)载体和植物双分子荧光互补(BiFC)载体的构建方法和策略进行了改进和创新。　　 主要研究结果如下:　　 1.建立了一种用于质粒载体改造和构建的新方法　　 本研究基于Golden Gate克隆技术，建立了一种快速和高效地进行载体改造和构建的新方法。该方法通过在DNA片段两端加带Ⅱ s类型的限制性内切酶位点并设计其酶切后产生的4bp粘性末端序列（接头），能通过一步酶切-连接反应同时把多个DNA片段或遗传模块拼接成环状质粒，完成载体构建;同时在拼接处可进行点突变、长片段缺失和插入等各类型的载体改造。使用该方法，成功进行了载体的改造，包括其它方法难以达到的复杂类型的载体改造，即同时在质粒的3个位点处进行碱基替换、酶切位点插入以及长片段缺失和插入。并且，使用该方法进行多个DNA遗传元件或模块的拼接，成功构建了原核表达载体和植物表达载体。该方法简单、快速、高效，且成本低，无需特殊试剂，有望在载体改造和构建上得到广泛应用。　　 2.创建了一种快速构建植物ihpRNA表达载体的新方法　　 随着RNA干扰(RNAi)技术在植物基因功能分析上的广泛应用，需要一种能高通量构建植物发夹RNA(hpRNA)表达载体的方法。本研究基于Golden Gate克隆技术，创建了一种构建含内含子发夹结构RNA(ihpRNA)表达载体的新方法。在此方法中，首先构建了一个与Golden Gate克隆系统配套的植物RNAi载体（命名为pRNAi-GG），用于ihpRNA表达载体的构建。pRNAi-GG含有一个2×35S启动子-BsaI位点-ccdB基因-BsaI位点-PDK内含子-BsaI位点-ccdB基因-BsaI位点-Nos终止子的表达框结构。使用该方法，只需在扩增靶基因序列的同时，由引物在序列两端加上相应的BsaI识别和切割位点，经一步酶切-连接反应后，此靶基因片段能同时以正向和反向的位置克隆到pRNAi-GG，形成ihpRNA表达载体结构。整个构建过程只需在一管中通过一个反应完成，且构建效率高，无背景干扰，同时由于pRNAi-GG为植物双元表达载体，构建好的ihpRNA表达载体可直接用于农杆菌转化研究。应用此方法，成功构建了多个基因的ihpRNA表达载体，包括单个的报告基因（GFP、GUS)和植物内源基因(PDS)，以及同时含两个基因片段（GFP/PDS）的嵌合型ihpRNA表达载体。通过农杆菌注射在烟草叶片瞬时表达，这些ihpRNA表达载体均能有效干扰其相应基因的表达。此方法具有简单、快速、高效、成本低等优点，为大规模的植物功能基因组研究提供了一个高通量平台。　　 3.发明了一种构建植物双分子荧光互补(BiFC)表达载体的新方法　　 双分子荧光互补(BiFC)技术能直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的相互作用。目前BiFC研究中使用的载体均为2个载体，分别带有荧光蛋白分割成的2个分子片段。本研究基于Golden Gate技术，构建了一个新的用于BiFC研究的植物双元表达载体pBiFC-GG。此载体上整合有荧光蛋白2个片段的表达框架，并且含有用于Golden Gate克隆的序列。2个目标蛋白基因通过PCR加带相应的Golden Gate克隆序列后，能通过一步酶切-连接反应同时克隆到pBiFC-GG载体上，分别与荧光蛋白的2个片段融合，随后可直接用于农杆菌转化进行表达研究。利用此载体进行BiFC研究只需构建和转化一个载体，并且构建过程高效、快速，极大地方便了载体的构建和转化过程，为植物BiFC研究提供了一种新系统。