应激（Stress）是指在各种紧张性刺激（应激源）下产生的个体层面的特异或非特异的适应性反应。严重的创伤性应激反应或长期处于应激中对人类的健康有着严重的危害,尤其是在一些高危作业中,病理性的应激反应影响作业人员的工作效率,增加工作中的失误,导致事故频发。严重的应激障碍具有症状复杂、病程长、潜在群体发病和缺乏特效治疗方法的特点,不仅会损害个体层面的健康,还可能对社会公共卫生、战场决战决胜、国家战略发展等造成严重的负面影响。据不完全统计,在当今社会普遍流行的疾病中,75%～90%与应激机制的激活相关。2018年世界卫生组织的相关调查结果显示,在过去10年间,经历过战争或重大灾害性事件的人群中约有五分之一（22%）患有应激相关的精神障碍性疾病。在抗击新冠疫情的过程中,一线抗疫人员应激反应的检出率高达73.4%。应激障碍成为影响个体健康和社会发展的重要原因之一。这促使人们渴望进一步了解应激的本质,并探索能够实时、准确检测应激反应程度的手段,为应激损伤的早期干预提供依据。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）是细胞线粒体电子传递链中的内源性关键分子,作为生物体内最重要的辅酶和核心代谢物,常被用作评价细胞代谢状态的关键指标。有研究发现,细胞内NADH水平的变化与机体应激反应程度呈正相关,提示检测细胞内NADH水平的变化有望达到对机体应激损伤状态的准确评估。本研究构建了一种可用于活体细胞内NADH水平检测的离子型荧光探针,重点验证并分析了其对细胞应激损伤模型的检测评估效果。主要研究结果如下:1.一种用于NADH检测的高灵敏度离子型荧光探针的构建本研究利用乙醇中回流处理合成关键中间体,采用碘甲烷对中间体进行N-甲基化修饰,获得对NADH具有荧光检测功能的离子型荧光探针C。荧光探针C以喹啉鎓盐作为NADH响应位点。在和NADH作用前,其结构的两端均带有正电荷,探针无荧光信号;当探针和NADH作用后,转化为一端具有正电荷的缺电子状态,另一端为连接胺基的富电子状态,从而在510 nm激发光下产生基于分子内电荷转移机制而形成的荧光发光现象。探针在与NADH反应后,会出现一种肉眼可见的浅黄色到粉红色的颜色变化。利用这种化学结构变化引起发光信号变化的原理可实现对细胞内NADH的荧光成像检测。2.NADH荧光探针C的检测效果评价为达到实时、准确地评估细胞应激损伤情况,对荧光探针C的特异性、灵敏性和稳定性进行进一步的验证。实验显示,荧光探针C可以排除生物体内常见的离子、基团、化合物等的干扰,特异性结合NADH;探针的检出限达到0.36 n M,远远低于正常生理水平,可以检测出细胞内NADH水平的微小变化;该探针具有较高的稳定性,在与NADH结合后,1小时内荧光信号不出现衰减,且在p H为4～9的范围内荧光信号强度未见明显干扰。此外,对探针在细胞内应用效果的分析试验表明,正常工作剂量（≤10μM）的探针溶液对细胞活力的影响较小。激光共聚焦显微成像和ρ~0细胞线粒体功能激活试验的结果表明,探针的工作位点可深入到线粒体细胞器水平,进一步肯定了荧光探针C的实用价值。3.PC12细胞应激损伤模型的构建与荧光探针C检测应用结合机体应激反应的本质,以PC12细胞为对象,构建了两种应激损伤模型,即激素（皮质酮）应激损伤模型和急性低氧应激损伤模型,并通过检测应激后主要指标的变化对模型的构建效果进行验证与评价。试验结果表明,在两种模型中,细胞内MDA、LDH、ATP和NADH水平均呈现上升趋势,SOD水平表现为下降趋势,基本符合应激强度梯度变化的要求,表明应激损伤模型的构建基本成功。使用荧光探针C检测细胞模型应激后NADH水平的变化,结果显示,随着模型应激程度的增加,细胞内NADH检出量逐渐增加。表明探针可实现细胞水平应激损伤状态的检测评估。综上,本研究通过化学合成法构建了一种专一、灵敏、稳定地离子型NADH荧光探针。通过在应激损伤模型中的检测应用,基本肯定了探针在细胞水平应激损伤评估中的应用价值。这为细胞应激水平分子代谢的检测评估提供了一种新的方法。