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目的:1.探讨烧伤延迟复苏时CD14+单核细胞HLA-DR表达率和外周血淋巴细胞凋亡率的变化及其与脓毒症和炎症介质的关系。2.探讨胸腺肽α1和卡巴胆碱对脂多糖刺激后人血CD14+单核细胞HLA-DR表达率及淋巴细胞凋亡率的影响3.探讨卡巴胆碱对脂多糖刺激引起人血单核细胞释放炎症介质的影响及其受体机制。方法:1.50例烧伤面积大于30%的烧伤患者,按伤后是否及时有效复苏分为延迟复苏组和非延迟复苏组,于伤后1、3、7、14、28 d取外周血,延迟复苏组患者住院期间发生脓毒症后连续两天取外周血。20例健康体检者外周血作为对照,流式细胞术检测CD14+单核细胞HLA-DR表达率和外周血淋巴细胞凋亡率,ELISA法测定血浆中TNF-α和IL-10的含量。2.分离、培养正常人外周血单核细胞和淋巴细胞,对照组仅加1640培养液,脂多糖（LPS）组加LPS刺激,LPS+卡巴胆碱组先用不同浓度卡巴胆碱（100、10、1、0.1、0.01μmol/L）预处理细胞后,再加入LPS（100ng/mL）刺激,LPS+胸腺肽α1组先用不同浓度胸腺肽α1（100、10、1、0.1、0.01μg/mL）预处理细胞后,再加入LPS（100ng/mL）刺激,培养12h后用流式细胞仪检测CD14+单核细胞HLA-DR表达率和外周血淋巴细胞凋亡率。3.取6例正常献血员外周血,密度梯度离心法分离单个核细胞,再利用单核细胞的贴壁性,分离获得单核细胞。用含10%胎牛血清的1640培养液重悬,调整细胞浓度为2×105/ml,加入包被了特异性捕获抗体的96孔板。实验分为6组:①空白对照组（C组）:85μl细胞+15μl1640;②LPS单独刺激组（L组）:85μl细胞+5μl LPS+10μl1640;③卡巴胆碱预处理组（K组）:85μl细胞+5μl卡巴胆碱+5μl LPS+5μl1640;④阿托品+卡巴胆碱预处理组（A+K组）:85μl细胞+5μl阿托品+5μl卡巴胆碱+5μlLPS;⑤α-Bgt+卡巴胆碱组预处理组（α-Bgt+K组）:85μl细胞+5μlα-Bgt+5μl卡巴胆碱+5μl LPS;⑥烟碱预处理组（N组）:85μl细胞+5μl烟碱+5μl LPS+5μl 1640。K组和N组的处理过程为加入卡巴胆碱或烟碱5μL,室温下静置5min;加入LPS 5μL。A+K组和α-Bgt+K组则在加入卡巴胆碱前5min加入阿托品或α-Bgt 5gL;L组仅加LPS和1640培养液,C组仅加1640培养液。在整个反应体系中各试剂终浓度分别为LPS 0.1μg/ml,卡巴胆碱和烟碱100gμmol/L,阿托品1mmol/L,α-Bgt 2μg/mL,K组预先用100、10、1、0.1、0.01μmol/L五个浓度组进行试验并采用最佳浓度100μmol/L进行机制探讨研究。所采用浓度参照文献[1]及预实验结果。检测TNF-α和IL-6时,细胞在37℃、5%CO2及95%空气、饱和湿度的CO2孵箱孵育12h,检测IL-10时孵育20h。洗去细胞,加入生物素标记的TNF-α、IL-6、IL-10检测抗体,经链酶亲和素藕联的辣根过氧化物酶催化底物显色后,效应细胞即单核细胞所在位置会留下约10-20/μm大小的斑点,一个斑点就代表一个细胞,斑点的大小可以反应每个细胞释放介质的多少。通过斑点计数可以确定分泌TNF-α、IL-6、IL-10的细胞数,斑点总密度是斑点总面积占整个孔底面积的百分比,表示细胞因子的浓度。处理完毕后经全自动免疫斑点图像分析仪分析检测。结果:1.烧伤患者外周血CD14+单核细胞HLA-DR表达率明显低于健康对照组（P＜0.01）,延迟复苏患者明显低于非延迟复苏患者（P＜0.01或P＜0.05）,发生脓毒症时CD14+单核细胞HLA-DR表达率基本都在10%以下,明显低于健康体检者及非脓毒症患者伤后1、7、14、28d（P＜0.01）。烧伤患者外周血淋巴细胞凋亡率明显高于健康对照组（P＜0.05）,延迟复苏患者明显高于非延迟复苏患者,差异在伤后3d和28d有统计学意义（P＜0.05）,脓毒症发生后外周血淋巴细胞凋亡率基本都在15%以上,明显高于健康体检者及非脓毒症患者伤后各天（P＜0.01）。延迟复苏组TNF-α检出率高于非延迟复苏组及对照组,且有统计学意义（P＜0.05）,检出样本中TNF-α含量亦高于非延迟复苏组,但差异无统计学意义。延迟复苏组脓毒症发生时TNF-α检出率和检出样本中的TNF-α含量均高于非脓毒症组血液标本和正常对照组（P＜0.05或P＜0.01）。外周血CD14+单核细胞HLA-DR表达率与IL-10水平呈负相关,在伤后1、7、28天有统计学意义（P＜0.01）。2.LPS单独刺激单核细胞时,其HLA-DR表达率明显降低,用卡巴胆碱或胸腺肽α1预处理后,HLA-DR表达率随着卡巴胆碱或胸腺肽α1浓度的增高而增高。LPS单独刺激淋巴细胞时,淋巴细胞凋亡率明显增加,而用卡巴胆碱或胸腺肽α1预处理后,淋巴细胞凋亡率随着卡巴胆碱和胸腺肽α1浓度的增高而降低。3.LPS单独刺激单核细胞时,TNF-α、IL-6、IL-10含量较对照组明显升高（P＜0.01）。用卡巴胆碱或烟碱预处理细胞后,TNF-α、IL-6含量明显下降,与LPS单独刺激组比较有统计学意义（P＜0.01）,但IL-10含量则无明显变化。卡巴胆碱在0.01-100μmol/L的浓度范围内,随着卡巴胆碱浓度的增加,其对LPS刺激下单核细胞产生TNF-α、IL-6的抑制作用也越明显。阿托品预处理细胞后,卡巴胆碱对LPS刺激下单核细胞释放TNF-α、IL-6的抑制作用无明显变化,而α-银环蛇毒素预处理细胞后,卡巴胆碱对TNF-α、IL-6的抑制作用明显减弱。结论:1.烧伤延迟复苏患者免疫功能低下,脓毒症患者则更为严重。外周血CD14+单核细胞HLA-DR表达率和淋巴细胞凋亡率可以作为动态检测患者的免疫功能状态的有效指标,CD14+单核细胞HLA-DR表达率低于10%,外周血淋巴细胞凋亡率高于15%对脓毒症的发生具有预警意义。2.烧伤延迟复苏患者体内炎症介质释放增加,抑炎介质IL-10对HLA-DR的表达具有抑制作用。3.卡巴胆碱和胸腺肽α1对LPS引起的人血单核细胞和淋巴细胞免疫功能下调有显著抑制作用。4.卡巴胆碱具有强大的抗炎作用,在单核细胞可能是通过N样胆碱能受体α7亚基实现的。