论文部分内容阅读
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2 ,PCV-2)属圆环病毒科(Circoviridae)无囊膜的单股DNA病毒,是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征及相关疾病的重要病原,已给我国养猪业带来了巨大的经济损失。因此,了解不同地区不同时间PCV-2毒株间的遗传差异,建立简便、快速的诊断方法,对预防和控制PCV-2的流行具有重要意义。本研究从我省不同地区采集病料,进行全基因组的克隆,通过对我省PCV-2流行毒株的分子流行病学研究,揭示我省PCV-2流行毒株的来源和变异情况,从分子水平上分析流行毒株之间的差异和PCV-2基因的遗传与进化,并建立了地高辛标记探针检测方法,以期为PCV-2免疫预防用疫苗的研究、诊断技术的建立等提供必要的理论依据。本研究共分为两个部分:第一部分:猪圆环病毒2型山东株全基因组的克隆与序列分析对2002-2004年从山东省不同地区规模化猪场采集的疑似断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)病料进行了PCV-2全基因组克隆和序列分析,结果表明PCV-2核苷酸序列较稳定,不同地区8株PCV-2毒株全基因组序列均由1767bp组成,彼此间核苷酸序列同源性达97.3%～99.8%,亲缘关系密切;与Genbank已发表的PCV-2参考毒株的同源性介于95.6%～99.8%。系统进化分析表明,这8株毒株与英、法及澳大利亚毒株亲缘关系较近,处于同一分支。本研究对所测定的8株PCV-2毒株的ORF1(编码Rep蛋白)和ORF2(编码Cap蛋白)分析表明,编码Rep蛋白的基因序列同源性为98.4%～99.7%,而编码Cap蛋白的同源性为96.6%～99.9%,由此可见PCV-2的变异主要集中在ORF2上。通过病毒结构蛋白的氨基酸序列比较发现,PCV-2毒株在氨基酸残基第53～91位变异区域较大,且差异显著,该区域与编码ORF2基因的主要免疫反应区域(第65～87位)相对应,可能与病毒逃避免疫应答的机制有关。另外,通过全基因组的序列比较分析发现,PCV-2存在两种基因亚型,一种基因组全长1768 bp;另一种基因组全长1767 bp,二者比较发现,所有的1767 bp亚型的毒株基因组在第1039位均缺失一个碱基T,在第1035位T突变为A,突变的结果,使TTA变为TAA产生了终止密码子,导致了ORF5的提前终止。第二部分:猪圆环病毒2型地高辛标记探针检测方法的建立与应用本研究成功建立了猪圆环病毒2型地高辛标记探针检测方法。根据Genbank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV-2)基因序列,在ORF2内设计一对特异性引物,利用PCR反应扩增出371bp的核酸片段,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,建立了地高辛标记核酸探针诊断PCV-2的方法。该探针与分离的8株PCV-2毒株重组菌的核酸抽提物均能发生特异性杂交,而与对照猪圆环病毒Ⅰ型(PCV-1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)的核酸杂交均为阴性;对PCV-2的最低检测量为10pg。结果表明,该研究建立的从临床组织病料中直接提取总DNA进行地高辛核酸探针检测方法,操作简便,一次可同时检测多个样品,检测结果稳定,重复性好,且在检测时,不需要特殊的仪器设备。为PCV-2的快速、准确诊断和流行病学调查提供了新的检测技术。