宫颈癌(human cervical cancer cells)的发病率在女性生殖器官恶性肿瘤中位居第一位,其是一种严重威胁女性生命健康的疾病。目前为止,宫颈癌最为常用的治疗手段为手术治疗、放射治疗及化疗。据统计有超过80%的宫颈癌患者需要放射治疗,而其疗效并不理想,临床上Ⅰ和Ⅱ期的患者经过放射治疗后生存率只有65%-85%,而Ⅲ、Ⅳ期的宫颈癌患者经过放射治疗后5年的生存率仅为20%-50%。对宫颈癌患者进行放射治疗后可能引起全身性的不良反应,如骨髓造血功能障碍、消化道不适,放射治疗还能够造成局部损伤,如放射性直肠炎、放射性膀胱炎、卵巢萎缩、盆腔组织纤维化等等,这给患者造成了不同程度的痛苦和多种损伤。临床上,放射治疗和化疗常常联合使用,如果在放射治疗前对患者进行放射治疗敏感性检测,并根据检测结果指导放射剂量的应用,可以最大化的减轻患者身体创伤并减少治疗费用,因此,研究宫颈癌细胞放射敏感性,寻找提高宫颈癌细胞放射敏感性的方法是目前研究的热点和重点。小檗碱(Berberine)又称为黄连素,是提取于毛茛科植物黄连、黄柏等根茎中的一种天然生物碱,属于异喹啉类,其具有广泛的生物学功能。小檗碱最初主要用于治疗胃肠道相关疾病,具有清热解毒及抗菌消炎作用,随着研究的不断深入,小檗碱还具有消炎、降血脂、降血压、抗心律失常、降血糖、改善胰岛素抵抗、降低雄激素等作用,其在消化道疾病、心血管、内分泌、妇科等多种疾病的治疗过程中具有一定的价值。近年来的研究表明,小檗碱还具有抗肿瘤作用。在体外的细胞实验中发现,小檗碱在安全非毒性的剂量范围内可以抑制多种癌细胞的生长,一方面它抑制多种致癌物质如亚硝基胍、杀鱼菌素、四氯化碳等对机体的损伤,并通过影响N-乙酰转移酶(N-acetyltransferase,NAT)的活性抑制癌细胞的正常生理功能;另一方面它可以阻滞癌细胞的细胞周期,抑制肿瘤细胞中脱氧核糖核苷酸(Deoxyribonucleotide acid,DNA)及蛋白的合成,使含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)级联反应激活,抑制癌细胞生长、诱导癌细胞凋亡,对不同种类的肿瘤细胞作用机制不同。小檗碱除了能够对肿瘤细胞起到直接杀伤作用之外,还可以通过增加对其他相关途径的调控作用进一步抑制肿瘤生长,例如:小檗碱可以加强紫杉醇对胃肠道相关恶性肿瘤的抑制作用,在三氧化二砷诱导的神经细胞瘤凋亡中小檗碱具有协同作用,并且小檗碱联合柔红霉素可以治疗白血病,另外,小檗碱还可以增加乳腺癌细胞、鼻咽癌细胞的放射治疗敏感性,因此,明确小檗碱对宫颈癌细胞生长、凋亡及放射敏感性的影响和机制对于临床治疗宫颈癌具有十分重要的意义。本研究以宫颈癌细胞为主要研究对象,用不同浓度的小檗碱处理后,运用CCK-8方法检测小檗碱对3株宫颈癌细胞的增殖活性的影响,筛选出作用较为明显的一株细胞作为研究对象,通过流式细胞术检测小檗碱对宫颈癌细胞凋亡及细胞周期的影响,用Western blot法检测小檗碱对宫颈癌细胞STAT3、p-STAT3水平的影响,最后通过细胞克隆实验绘制细胞存活曲线,并根据单击多靶模型参数计算放射增敏比,以明确小檗碱对宫颈癌放射敏感性的影响,并对其可能的作用机制进行探讨,这对研究小檗碱的抗肿瘤作用和放射增敏作用具有重要意义。第一部分小檗碱对宫颈癌细胞增殖的影响研究方法在体外培养3株宫颈癌细胞Siha、HeLa、Caski,分别用含有小檗碱终浓度为5、10、15、20 μmol/L的细胞培养液培养3株细胞,同时用不含有小檗碱的细胞培养液培养3株细胞,48h后,用CCK-8法检测细胞增殖活性,并计算半数抑制浓度。结果5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L 小檗碱作用后的宫颈癌细胞 Siha、HeLa、Caski的增殖活性与对照组细胞相比均明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。小檗碱可以抑制Siha、HeLa、Caski细胞增殖,其半数抑制浓度分别为:(16.84±3.52)μmol/L、(23.54±8.67)μmol/L、(21.86±6.35)μmol/L。小檗碱对Siha细胞抑制生长的作用比其他两株细胞更强。结论小檗碱可以抑制宫颈癌细胞Siha、HeLa、Caski的增殖,其对Siha细胞抑制生长的作用比其他两株细胞更强。后续可选用17 μmol/L的小檗碱作用于Siha细胞进一步研究。第二部分小檗碱对宫颈癌细胞周期及凋亡的影响研究方法1.用半数抑制浓度的小檗碱作用于宫颈癌Siha细胞48 h,流式细胞术检测细胞凋亡。2.用半数抑制浓度的小檗碱作用于宫颈癌Siha细胞48 h,Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3水平。3.用半数抑制浓度的小檗碱作用于宫颈癌Siha细胞48 h,流式细胞仪检测细胞周期。4.用半数抑制浓度的小檗碱作用于宫颈癌Siha细胞48 h,Western blot检测细胞周期相关蛋白CyclinBl、CDK1表达水平。结果1.半数抑制浓度的小檗碱作用后的Siha细胞凋亡率为(32.25±1.25)%,而经过不含有小檗碱作用后的Siha细胞凋亡率为(9.32±0.95)%,二者相比差异具有统计学意义(P<0.05)。小檗碱作用后的宫颈癌Siha细胞凋亡增多。2.半数抑制浓度的小檗碱作用后的Siha细胞中Cleaved Caspase-3水平升高,以GAPDH为内参,Cleaved Caspase-3表达量为0.97±0.09,而没有经过小檗碱处理后的Siha细胞中Cleaved Caspase-3表达量为0.23±0.06,二者相比差异有统计学意义(P<0.05)。小檗碱可能通过提高Cleaved Caspase-3表达,促进宫颈癌细胞凋亡。3.半数抑制浓度的小檗碱作用后的Siha细胞G2/M期比例为(42.91±4.57)%,而没有经过小檗碱处理后的Siha细胞G2/M期比例为(7.68±1.23)%,二者相比差异具有统计学意义(P<0.05)。说明小檗碱能够将细胞阻滞在G2/M期。4.半数抑制浓度的小檗碱作用后的Siha细胞中CyclinBl、CDK1蛋白水平均下降,以GAPDH为内参,CyclinB1蛋白表达量为0.85±0.07,CDK1蛋白表达量为0.36±0.04,而没有经过小檗碱处理的Siha细胞中Cyclin]B1蛋白表达量为1.14±0.08,CDK1蛋白表达量为1.09±0.12,二者相比差异具有统计学意义(P<0.05)。提示小檗碱可能通过降低CyclinBl、CDK1蛋白水平影响宫颈癌细胞周期。结论1.小檗碱通过提高Cleaved Caspase-3表达诱导宫颈癌Siha细胞凋亡。2.小檗碱通过降低CyclinB1、CDK1蛋白水平,将宫颈癌Siha细胞阻滞在G2/M 期。第三部分小檗碱对宫颈癌细胞STAT3、p-STAT3水平影响研究方法用半数抑制浓度的小檗碱作用于宫颈癌Siha细胞48h,Western blot检测STAT3信号通路相关蛋白STAT3、p-STAT3水平。结果半数抑制浓度的小檗碱作用后的Siha细胞中STAT3蛋白表达水平没有明显变化,而p-STAT3水平下降。以GAPDH为内参,半数抑制浓度的小檗碱作用后的Siha细胞中p-STAT3蛋白表达量为0.15±0.04,未经小檗碱处理的Siha细胞中p-STAT3蛋白表达量为0.82±0.06,二者相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。小檗碱可能通过降低STAT3磷酸化影响宫颈癌细胞的生长和凋亡。结论半数抑制浓度的小檗碱作用后的Siha细胞中STAT3蛋白表达水平没有明显变化,而p-STAT3水平下降。小檗碱可能通过降低STAT3磷酸化水平影响宫颈癌细胞的生长和凋亡。第四部分小檗碱对宫颈癌细胞放射敏感性影响研究方法含有半数抑制浓度的小檗碱培养液培养宫颈癌Siha细胞,用0、2、4、6、8 Gy X射线照射细胞,细胞克隆形成实验检测放射敏感性。结果半数抑制浓度的小檗碱作用后的Siha细胞存活分数降低,小檗碱能够提高宫颈癌的放疗敏感性,增敏比为1.550。结论小檗碱能够抑制宫颈癌细胞增殖,促进凋亡,阻滞细胞周期,增加宫颈癌细胞的放射敏感性。