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肠杆菌科细菌为临床常见的条件致病菌，能引起脓毒症、菌血症、肺炎等感染性疾病。在抗菌药物应用日益频繁的今天，细菌的耐药性也日趋严重，给临床抗感染治疗带来了严峻挑战。尽管新的β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗菌药物的不断研发问世，在治疗革兰阴性菌引起的重症感染中，氨基糖苷类药物仍然占有重要的地位，如氨基糖苷类与β-内酰胺类联合应用往往用于治疗严重的细菌感染。但是，新的耐药机制导致的对氨基糖苷类与β-内酰胺类耐药，尤其是对碳青霉烯类耐药现象的出现，使抗感染治疗濒临无药可选的困境。本研究对这两类抗菌药物耐药的肠杆菌科细菌进行深入研究，分析其分子流行机制，并且把耐药基因与其遗传环境有机联系起来，全面、系统地研究其耐药性转移的机制及各耐药机制之间的相互联系。
一、瑞金医院临床分离肠杆菌科细菌分布及耐药性分析。研究目的：2006年10月～2007年5月我院临床分离的肠杆菌科细菌临床感染现状、细菌分布特点及其耐药特征，以利于临床合理选用抗菌药物，控制医院感染爆发流行。方法：收集临床各科室分离的肠杆菌科细菌，记录临床信息，用纸片扩散法测定对15种抗菌药物的敏感性，应用WHONET5.3软件进行分析统计。结果：收集我院临床各类标本中分离到肠杆菌科细菌1055株，占革兰阴性菌的57.3％。其中占前三位的分别是大肠埃希菌(723株)、肺炎克雷伯菌(202株)和阴沟肠杆菌(60株)。肠杆菌科细菌在各送检病区中，门诊患者分离率最高，达42.9％，其次为内科病区和外科病区，分别占16.8％和16.2％。标本来源中，分离自中段尿的最高，占53.5％，其次为痰和血液，分别占16.9％、6.0％。对15种抗菌药物耐药性分析可见，前三种细菌对氨苄西林的耐药率最高，均在80.0％以上。对第一、二代头孢菌素的耐药率均在35.0％之上。阴沟肠杆菌对第三代头孢菌素的耐药率较高，高于55.0％，对第四代头孢菌素头孢吡肟的耐药率则为21.7％。大肠埃希菌对头孢噻肟的耐药率为41.3％，对头孢他啶的耐药率则为11.5％，对头孢吡肟则为11.9％。肺炎克雷伯菌对第三代头孢菌素的耐药率在20.0％～28.0％之间，对头孢吡肟则为10.6％。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和变形杆菌产ESBLs的比例分别为49.1％、37.0％和2.0％。仅阴沟肠杆菌存在5株对亚胺培南的耐药菌株。结论：我院肠杆菌科细菌主要来源为门诊患者和内、外科病房，主要感染部位为泌尿系统和下呼吸道。肠杆菌科细菌对常用抗菌药物耐药现象较为严重，治疗此类细菌感染宜参考细菌药敏试验结果，选用敏感的抗菌药物，并对其加强监测。
二、肠杆菌科细菌16S rRNA甲基化酶基因的研究。研究目的：对我院分离的对氨基糖苷类耐药的肠杆菌科细菌进行了16S rRNA甲基化酶分型，分析其分子流行趋势，以了解质粒介导的16S rRNA甲基化酶所致高水平氨基糖苷类耐药性的形成和传播机制。方法：用纸片扩散法筛选庆大霉素和/或阿米卡星耐药的肠杆菌科细菌；PCR扩增16S rRNA甲基化酶基因armA、mtA、rmtB、rmtC、rmtD，npmA；氨基糖苷修饰酶基因aac(3)-I、aac(3)-II、aac(6’)-Iad、aac(6’)-Ib、aac(6’)-II、ant(3)-I、ant(2")-I；β-内酰胺酶基因TEM、SHV、CTX-M-1、2、8、9、25、PER-1、VEB-1；质粒接合试验验证16S rRNA甲基化酶的转移性；PFGE法对16S rRNA甲基化酶基因阳性菌株进行分型。结果：201株对庆大霉素和/或阿米卡星耐药肠杆菌科细菌中共检出38株16S rRNA甲基化酶阳性株，其中16株(4株大肠埃希菌、6株肺炎克雷伯菌、6株阴沟肠杆菌)为armA基因阳性株；22株(20株大肠埃希菌、2株肺炎克雷伯菌)为rmtB阳性株。在723株大肠埃希菌、202株肺炎克雷伯菌和60株阴沟肠杆菌中，armA的分离率分别为0.6％、3.0％和10％； rmtB在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的分离率分别为2.8％和1.0％。38株16S rRNA甲基化酶基因阳性株对氨基糖苷类呈现高水平耐药，MIC50和MIC90均>256 mg/L。36株对环丙沙星耐药，耐药率高达94.7％(36/38)，5株阴沟肠杆菌对亚胺培南耐药。有30株可通过接合试验将耐药质粒转移至受体菌。blaCTX-M-14、blaTEM-1和blaSHV-12可连同armA或rmtB分别转移到11、20和7个接合子中。上述肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和阴沟肠杆菌分别被PFGE分为4、21和1个型别。结论：我院肠杆菌科细菌16S rRNA甲基化酶以ArmA和RmtB为主要流行型别，且后者分离率较高，酶基因阳性株呈水平传播与克隆传播状态。该甲基化酶可导致氨基糖苷类高水平耐药，而且酶编码基因位于质粒上，具有转移性。β-内酰胺酶基因和氟喹诺酮耐药决定因子可随之一同转移。
三、阴沟肠杆菌对碳青霉烯类耐药机制的研究。研究目的：探讨我院分离的5株泛耐药阴沟肠杆菌对碳青霉烯类耐药的机制、基因环境及传播机制。方法：用E test法检测5株泛耐药阴沟肠杆菌对10种抗菌药物的MIC值；三相水解试验检测酶粗提物对碳青霉烯类的水解活性；质粒接合法验证碳青霉烯类耐药决定因子是否具有转移性；鸟枪克隆法克隆碳青霉烯类耐药决定因子，并对克隆片断进行测序；等电聚焦电泳法检测β-内酰胺酶；Southern杂交法对耐药决定因子进行定位；提取外膜蛋白，分析其在碳青霉烯类耐药中的作用。结果：5株阴沟肠杆菌对10种抗菌药物的MIC值均>32μg/ml；粗酶提取物均可水解亚胺培南和美罗培南，水解活性不被氯唑西林和EDTA抑制，但可被克拉维酸抑制；克隆的耐药决定因子为b/aKPC-2，酶编码基因上游为一转座酶基因，blaKPC-2基因两侧为复制靶位，其下游为ISKpn6的插入序列，该序列包括一个重复序列和tnpA转座子，酶编码基因位于54.2kb的一个非接合性大质粒上；等电聚焦电泳显示5株菌产pI5.4，6.7，8.2和8.4的条带分别与TEM-1、KPC-2、SHV-12和CTX-M-14相对应。结论：我院分离的泛耐药阴沟肠杆菌对碳青霉烯类耐药由产碳青霉烯酶KPC-2所介导。酶基因位于非接合性质粒上，与转座子相关。blaKPC-2与armA型16S rRNA甲基化酶基因不存在相关性。临床应加强对这类泛耐药肠杆菌科细菌的监控，以防止其扩散造成更严重的医院感染。