瘦素在猪胚胎附植中的功能及其信号通路的研究

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母猪产仔数是一个重要的繁殖性状,胚胎附植期是影响猪产仔数的关键时期。越来越多证据表明瘦素对哺乳动物生殖起重要调节作用,尤其是在胚胎附植过程中。本研究针对瘦素在胚胎附植期猪子宫内膜的时空表达模式、瘦素细胞水平的功能验证、瘦素诱导的系列信号通路展开了研究。试验一,选取12头3-5胎龄大白母猪分为:对照组(发情周期13-18天的未妊娠猪);胚胎附植早、中、晚期组(妊娠13天、18天、24天)(每个处理3头猪)。采用RT-PCR、WB法研究瘦素及受体在猪子宫内膜中的时空表达模式,采用免疫组化法确认瘦素及受体在猪子宫内膜中的定位。结果发现,瘦素mRNA和蛋白均在胚胎附植点表达高于非附植点(P<0.05)。妊娠18天,瘦素受体mRNA在附植点的表达低于非附植点(P<0.05),其蛋白表达在附植点高于非附植点(P<0.05)。瘦素mRNA在附植点的表达随着附植进行逐渐升高(P<0.05);其受体mRNA和蛋白表达变化趋势与瘦素相反。瘦素在未妊娠猪中分布于子宫内膜的腔上皮、基质、腺上皮;在妊娠猪中主要分布在腔上皮,少量分布在腺上皮。试验二,猪子宫内膜上皮细胞体外模型的建立。选取妊娠18天经产大白母猪任意侧子宫角,无菌处理,分离内膜组织于37℃,5%CO2进行原代培养。利用胰酶差速消化法分离纯化出上皮细胞;利用角蛋白是上皮细胞的特异性表达蛋白这一特征,采用免疫细胞化学的方法对上皮细胞进行定性检测;采用MTT法绘制猪子宫内膜上皮细胞体外生长曲线。结果表明,采用组织块法成功建立了能在体外条件下正常传代、冻融、生长的猪子宫内膜上皮细胞。试验三,细胞水平上对瘦素进行功能验证。分别添加0nM、0.01nM、0.1nM、1.0nM、10nM瘦素处理细胞24/48h。采用MTT法检测瘦素对猪子宫内膜上皮细胞增殖的影响,RT-PCR、WB法检测瘦素对胚胎附植相关因子表达的影响,用试剂盒法检测瘦素对细胞抗氧化能力的影响。结果表明,与对照组比,瘦素处理猪子宫内膜上皮细胞24h和48h并没对细胞的增殖产生显著的影响(P>0.05),瘦素对猪子宫内膜上皮细胞中胚胎附植相关因子的表达普遍具有上调作用,且具有浓度依赖性。瘦素能浓度依赖性的下调细胞ROS、MDA浓度(P<0.05),上调SOD2mRNA表达(P<0.05),提高GSH-PX和SOD酶活,从而增强细胞抵抗氧化损伤的能力。试验四,研究信号通路阻断剂AG490、LY294002、U0126对瘦素调节猪子宫内膜上皮细胞中胚胎附植相关因子表达和细胞抗氧化能力的影响。结果发现JAK2、PI3K参与了瘦素调控所有胚胎附植相关因子的表达过程,MAPK选择性地参与了瘦素对上述因子的调控。瘦素调控细胞抗氧化能力的主要信号通路为MAPK。结论,瘦素时空特异性表达于妊娠猪子宫内膜中,且能通过影响猪子宫内膜上皮细胞中胚胎附植相关因子的表达、调节细胞抗氧化能力对猪胚胎附植产生调节。JAK2、PI(3)K、MAPK通路不同程度的参与了瘦素对胚胎附植相关因子表达和细胞抗氧化能力的调控过程。其中,PI(3)K和MAPK分别是瘦素调控胚胎附植相关因子和细胞抗氧化过程的重要通路。
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