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第一部分hPOT1在宫颈癌及癌旁组织中的表达及其临床意义目的：研究端粒保护蛋白hPOT1在宫颈癌和癌旁正常宫颈组织中的表达差异,以及hPOT1表达与宫颈癌临床病理特征之间的关系,探讨hPOT1在宫颈癌发生、发展中的作用。方法：应用免疫组织化学方法检测94例宫颈癌组织和12例癌旁正常宫颈组织中hPOT1蛋白的表达情况。参照文献方法,采用hPOT1阳性指数(Positive Index, PI)来进行结果判定。比较hPOT1阳性指数在宫颈癌组织和宫旁正常组织中的差异。并根据hPOT1阳性指数将94例宫颈癌组织分为低表达组(≤30%)和高表达组(>30%),分析两组在年龄分布、病理类型、病理分级、T分期以及有无淋巴结转移方面的统计学差异。结果：免疫组化检测结果显示,hPOT1蛋白主要表达于宫颈癌和正常宫颈组织的细胞核内,染色呈棕黄色颗粒。hPOT1蛋白在宫颈癌组织中的阳性指数为31.52±8.95%,明显高于其在癌旁组织中的阳性指数(15.50±4.26%,P<0.001)。hPOT1蛋白低表达组和高表达组的阳性指数分别为23.04±6.36%和40.76±6.49%(P<0.001)。两组的年龄分布、病理类型(宫颈鳞癌与非鳞癌)、病理分级(G1-2/G3)、淋巴结转移与否(N0/N+)均无显著性差异(P>0.05)。但是,在hPOT1高表达组中T2-3期比例(29/45)明显高于T1期比例(16/45),在hPOT1低表达组中T1期比例(35/49)显著高于T2-3期比例(14/49),两组差异有统计学意义(P<0.001),表明T分期越晚,hPOT1表达水平越高。结论：端粒保护蛋白hPOT1表达升高与宫颈癌的发生、发展过程密切相关,hPOT1可能成为抗肿瘤治疗的潜在靶点。第二部分抑制hPOT1表达对宫颈癌细胞放射敏感性的影响目的：建立稳定转染慢病毒载体重组hPOT1-shRNA质粒的宫颈癌C33A细胞模型,以此来研究抑制hPOT1表达对C33A细胞放射敏感性的影响,探讨hPOT1成为宫颈癌放射增敏靶点的可能性。方法：构建靶向抑制hPOT1的重组慢病毒载体pGMLV-SC5-hPOT1-shRN A及相应的阴性对照空质粒载体pGMLV-SC5-Neg-shRNA,稳定转染C33A细胞,然后分别通过qRT-PCR法和Western blot方法检测hPOT1mRNA含量和蛋白表达水平的变化；通过克隆形成实验,运用GraphPad Prism5.0软件结合单击多靶模型公式拟合细胞存活曲线,得到SF2、Do、Dq、N值,计算放射增敏比SERSF2和SERDq。结果：本实验成功构建了靶向抑制hPOT1的重组慢病毒载体,并成功转染C33A细胞,建立了稳定转染的实验组细胞模型C33A/hPOT1-shRNA和相应的阴性对照组细胞模型C33A/Neg-shRNA。经qRT-PCR和Western blot方法验证,C33A/hPOT1-shRNA细胞的hPOT1mRNA相对含量和蛋白表达水平显著降低(p<0.001)。克隆形成实验结果显示,C33A/hPOT1-shRNA和C33A/Neg-shRNA细胞的SF2分别为0.380±0.059和0.563±0.072(P=0.0003),Do分别为1.428和1.658,Dq分别为0.983和2.393。抑制hPOT1后得到SERSF2和SERDq值分别为1.482、2.432。结论：靶向性抑制hPOT1表达能够增加宫颈癌C33A细胞对放射线的敏感性,hPOT1有可能成为宫颈癌放射增敏的靶点。第三部分抑制hPOT1表达对宫颈癌细胞放射增敏作用机制的研究目的：进一步探讨抑制hPOT1表达提高C33A细胞放射敏感性的机制。方法：靶向抑制C33A细胞hPOT1表达后,通过Southern Blot方法检测稳定转染细胞传代至8-10代时的平均端粒长度；TRAP-PCR-ELISA方法检测端粒酶活性；流式细胞术检测细胞经过X线照射后不同时间点的细胞凋亡水平和细胞周期分布的变化；细胞免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜检测辐射后细胞核内γ-H2AX灶点变化(反映DNA损伤及修复)。结果：靶向抑制C33A细胞的hPOT1蛋白表达,对端粒酶活性无明显影响；但导致其子代细胞的平均端粒延长(8.78±0.726kb比7.20±0.551kb,p=0.0055)：并增加了C33A细胞的自发性凋亡率(4.07±0.52%比5.16±0.67%,t=2.57,p=0.042)和辐射诱导的凋亡率(43.16+3.11%比34.95%+4.56,t=2.97,p=0.025)；降低了辐射后细胞周期G2/M期阻滞的比例(12h点t=5.995,p<0.001；24h点t=9.527,p<0.001；48h点t=12.81,p<0.001),缩短了G2/M期阻滞的持续时间。通过激光共聚焦显微镜观察辐射后C33A细胞核内的γ-H2AX灶点,我们发现抑制hPOT1蛋白表达导致5Gy X线照射后0.5h γ-H2AX灶点明显增多(P<0.001),到照射后12h,C33A/hPOT1-shRNA细胞核中残留的γ-H2AX灶点仍明显多于阴性对照组细胞C33A/Neg-shRNA,表明靶向抑制hPOT1导致辐射诱导的DSB损伤增多且DSB修复能力下降或者延迟。结论：靶向抑制hPOT1表达增加C33A细胞放射敏感性的机制与端粒酶活性变化无关,而可能与端粒延长但端粒不稳定性增加有关。抑制hPOT1表达减弱和缩短了G2/M期阻滞,可能导致未经修复或修复不完全的细胞进入有丝分裂期,进一步增加端粒的不稳定性,增加细胞凋亡,从而导致放射增敏。另外,辐射后DSB损伤增多和DSB修复能力下降或修复延迟也可能与hPOT1的放射增敏作用有关。总之,抑制hPOT1表达导致C33A细胞放射敏感性增加,hPOT1有可能成为宫颈癌放射增敏的重要靶标之一,本研究为寻找放疗增敏的新靶标提供了有利的理论依据。