环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶,EC2.4.1.19)能够通过分子内转糖苷反应将淀粉及淀粉类似物转化为环糊精。由于环糊精能与客体分子形成包含复合物,改变客体分子的物理和化学性质,因而在食品、医药和化妆品等领域的应用越来越广,CGT酶已成为当今研究的热点。　　 本实验室前期的研究工作中,成功实现了Paenibacillus maceransα-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT酶)在大肠杆菌中的胞外分泌表达。但研究中我们发现无论是天然α-CGT酶还是重组酶酶制剂的热稳定性均较差,不利于规模化的工业应用。为了提高重组α-CGT酶的稳定性,本研究从基因水平、大分子化学修饰水平和改变酶分子微环境水平三个方面对α-CGT酶的热稳定性开展了研究。此外,用圆二色光谱(CD)分析了α-CGT酶的热稳定性与其天然结构之间的关系,并对多羟基化合物对酶分子的稳定机理做了初步研究。主要研究结果如下:　　 (1)纯化了来源于P.macerans的天然α-CGT酶以及来源于Escherichia coli和Bacillus subtilis的重组酶,经热处理后发现来源于P.macerans,E.coli和B.subtilis的α-CGT酶残酶活分别为28％,30％和25％。可见,来源于不同菌种的α-CGT酶的热稳定性相似,若直接使用,均不能达到工业用酶制剂的要求。根据三种菌对α-CGT酶的产量,最终确定将来源于E.coli的重组α-CGT酶作为本课题后续的研究对象。　　 (2)分析了重组α-CGT酶的最适贮存pH和贮存蛋白浓度。结果显示pH6.5,蛋白含量为4 mg/mL的α-CGT酶热稳定性最好。将蛋白含量为4 mg/mL,pH6.5的粗酶制剂分别在4℃、25℃和37℃贮存。当酶液在4℃和25℃贮存时,T1/2分别为108 d和50 d,在37℃贮存时α-CGT酶的酶活很快下降,T1/2为2.9 d,一周后酶活完全丧失。　　 (3)采用定点突变技术研究了盐桥对提高重组α-CGT酶热稳定性的影响。对突变体的研究表明,单突变酶CGTM-1(K192R)热稳定性较未突变的没有太大提高;突变三个氨基酸后的突变酶CGTM-3(T185S/I186Y/K192R)热稳定性有了明显提高。在50℃水浴30min后突变酶CGTM-3残酶活是对照的两倍多。将蛋白含量为4 mg/mL,pH6.5的突变酶CGTM-3粗酶制剂分别在4℃、25℃和37℃贮存,定时取样测酶活,得出其T1/2分别为120 d、80 d和7 d。　　 (4)采用戊二醛交联的方法研究了化学修饰对提高重组α-CGT酶稳定性的影响。Α-CGT酶经戊二醛交联成大分子聚合物后,50℃水浴30 min发现与对照相比酶的热稳定性有所提高,但是交联过程中酶活损失了50％。后用α-CGT酶粗酶液进行交联,虽然交联过程酶活损失有所降低,酶的稳定性也有所提高,但仍不能满足工业化应用要求。　　 (5)采用向α-CGT酶液中添加化学添加剂研究了酶分子微环境的改变对提高重组α-CGT酶的稳定性的影响。当单独加入各种保护剂在50℃水浴1 h和室温放置108 d后,发现含有20％甘油的酶液稳定性最好,与未加任何添加剂的对照酶液相比仍有91％和50％的酶活,对照酶液在50℃水浴1 h后仅有小于10％的活性,室温放置108 d后已经没有酶活。明胶、CaCl2和PEG400也有一定的保护效果。将四种保护剂分别以最佳浓度组合叠加添加到α-CGT酶发酵液中40℃贮存45 d,发酵液中α-CGT酶的残酶活几乎不变,维持在100％左右。采用圆二色谱(CD)研究不同条件下酶的热稳定性变化与蛋白质构象变化之间的关系。发现保护剂有利于维持酶天然三维构象,明显降低高温条件下α-CGT酶的变性程度,使酶在高温时仍保持较高的酶活。此外,通过不同分子量的PEG和甘油对α-CGT酶保护效果的研究发现,多羟基化合物的羟基含量可能是影响α-CGT酶分子热稳定性的重要因素。