由于肿瘤、炎症、外伤和发育异常而导致的骨组织缺损是临床上常见疾病之一，传统的修复方法存在一定的缺陷，组织工程的出现为骨组织缺损修复重建开辟了新的途径。可注射组织工程骨是利用组织工程学的基本原理，选用可注射性细胞外支架材料构建的组织工程骨，具有损伤小、易操作的优点，成为目前组织工程领域研究的一大热点。可注射组织工程骨的研究主要从三个方面进行：①体外种子细胞培养最佳条件和环境的研究；②三维生物支架材料的开发和性能研究；③可注射组织工程骨的构建方法研究。本实验围绕着以上三个方面，以藻酸钙为细胞载体展开一系列研究，为尽早将可注射组织工程骨应用于临床提供理论依据。 第一部分 犬骨髓基质成骨细胞的分离、培养及生物学行为观察 实验一 犬骨髓基质成骨细胞的体外培养与鉴定 目的：观察犬骨髓间充质细胞在体外培养中向成骨细胞分化及体外成骨表型。方法：通过穿刺方法从犬髂骨抽取骨髓，在常规培养液(含10％胎牛血清的DMEM培养液)和诱导培养液(加入地塞米松、β-磷酸甘油钠、维生素C的培养液)中进行培养，观察细胞生长状态，测定生长曲线，观察成骨细胞特异性蛋白分泌情况。结果：在诱导液中培养的犬骨髓间充质细胞较常规培养液中培养的细胞更丰满，骨髓间充质细胞经诱导培养后可表达成骨细胞特异性蛋白。但生长速度明显减慢。结论：通过穿刺获取的骨髓间充质干细胞可通过体外诱导培养分化为成骨细胞。 实验二 以藻酸钙为载体体外培养骨髓基质成骨细胞的生物学行为研究 目的：研究骨髓基质成骨细胞在藻酸盐凝胶中的生物学行为。方法：将体外培养、分化、扩增的犬骨髓基质成骨细胞与藻酸盐溶胶复合，构成骨髓基质成骨细胞／藻酸钙凝胶复合体，继续体外培养，观察骨髓基质成骨细胞在藻酸盐凝胶中的生长状况和成骨细胞特异性蛋白表达。结果：骨髓基质成骨细胞被包埋在三维立体网状结构的藻酸钙凝胶中，呈悬浮状生长；5天后扫描电镜下显示有少量细胞外基质分泌；细胞维持成骨细胞的特异性蛋白质分泌。结论：骨髓基质成骨细胞在藻富 强 第四军医大学博士学位论文酸钙凝胶中保持了成骨细胞的特性，并有少量基质分泌，提示藻酸钙凝胶可以用作成骨细胞的支架材料。第二部分藻酸钙凝胶理化性能研究实验一藻酸钙凝胶理化性能测定目的：为了合理使用藻酸钙凝胶于可注射组织工程骨中，对藻酸盐溶胶的pH值和藻酸钙凝胶的机械强度进行测定。方法：将藻酸盐制成 30g／L的溶胶，在pH七型酸度计上测量pH值；再通过向藻酸盐溶胶内加入硫酸钙的方法，将藻酸盐溶胶制成特定形状的藻酸钙凝胶，然后在万能材料试验机上测量藻酸钙凝胶的压缩强度、拉伸强度和弯曲强度。结果：藻酸盐溶胶的pH值为7．332，略偏碱性；压缩强度为440刀OKPa、拉伸强度为133．75KPa、弯曲强度为56．25KPa。结论：藻酸盐酸碱度为中性略偏碱，藻酸钙凝胶机械强度较差，不直在受力部位单独使用。实验二不同消毒方法对藻酸盐凝胶理化性能的影响目的：研究不同消毒方法对藻酸盐凝胶理化性能的影响。方法：将藻酸盐制成 30g／L的溶胶，分别采用的钴照射消毒和高压蒸汽消毒，在 pH上型酸度计上测量 pH值；再通过向藻酸盐溶胶内加入硫酸钙的方法，将藻酸盐溶胶制成特定形状的藻酸钙凝胶，然后在万能材料试验机上测量藻酸钙凝胶的压缩强度、拉伸强度和弯曲强度。结果：藻酸盐溶胶经两种方法消毒后pH值均明显下降，呈低度酸性，其中高压蒸汽消毒较一钻照射消毒对酸碱度影响更明显；经两种方法消毒后藻酸盐凝胶机械强度均明显下降，其中一钻照射消毒较高压蒸汽消毒对机械强度影响更明显。结论：用钻照射消毒和高压蒸汽消毒都可以使藻酸盐溶胶pH值下降，使用前应作pH值调整；高压蒸汽消毒对藻酸钙凝胶机械强度影响相对较小，建议使用。第三部分氯化钙对骨髓基质成骨细胞的影响实验一 氯化钙对成骨细胞增殖和分化的影响国的：研究不同浓度氯化钙对骨髓基质成骨细胞增殖与分化的影响。方法：从兔筋骨中获取骨髓基质成骨细胞，将骨髓基质成骨细胞置于食不同浓度氯化钙的细胞培养液中，培养24h、72h。120h后，通过检测骨髓基质成骨细胞的代谢活性和碱性磷酸酶活性。观察不同浓度氯化钙对成骨细胞增殖和分化的影响。结果：随着细胞培养液中氯化钙浓度的升高，骨髓基质成骨细胞的代谢活性和碱性磷酸酶活性均降低。结论：氯化钙对骨髓基质成骨细胞增殖与分化有一定的抑制作用。实验二不同浓度氯化钙对成骨细胞的细胞毒性研究 一3－曹 强 第四军医大学博士学位论文目的：研究不同浓度氯化钙对骨髓基质成骨细胞的细胞毒性作用。方法：从兔滚骨中获取骨髓基质成骨细胞，将骨髓基质成骨细胞与不同浓度氯化钙溶液进行不同时间的接触，然后再在细胞培养液中培养24h，通过观察骨髓基质成骨细胞的形态改变和细胞代谢活性的改变，了解不同浓度氯化钙对骨髓基质成骨细胞的细胞毒性。结果：