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小分泌蛋白参与植物的生长发育、逆境响应等诸多方面,最近几年发现了很多在生殖方面有重要作用的小分泌蛋白,例如玉米的ZmEA1、ZmES4等。玉米作为重要的经济作物和模式植物,对其小分泌蛋白进行深入详细的研究有重要的理论和应用价值。
本研究首先根据玉米(Zea mays) B73自交系基因组测序后预测的蛋白序列,依据以下的标准查找玉米基因组编码的所有的小分泌蛋白:(1)氨基酸数目少于等于200;(2)有分泌信号肽;(3)没有跨膜区;(4)没有内质网驻留序列。共发现1732个小分泌蛋白。利用Clastal X2、MEGA5、Claster3.0等分析软件,借助于NCBI、ExPasy、maizesequence、maizegdb等网站,对小分泌蛋白进行了分析。
首先根据蛋白质序列的保守结构域、以及是否翻译后修饰、半胱氨酸的分布模式等对小分泌蛋白进行了分类。玉米723个小分泌蛋白分布在195个超级家族中,不同超家族成员的数目差别很大,其中AAI LTSS超家族的成员数量最多,共有93个蛋白;只有1个成员的超家族有93个;有1009小分泌蛋白不包含已知的保守结构域。拟南芥中的翻译后修饰小分泌蛋白有6类,而玉米中只有CLV3/CLE、PSK、RGF这3类,没有发现CEP、PSY1、IDA的同源序列。此外,在玉米中没有发现RTFL、NCR等其它植物中存在的小分泌蛋白的同源序列。玉米小分泌蛋白的半胱氨酸、甘氨酸、亮氨酸含量很高,其中AAI LTSS、BAP、GASA、Knotl等19个超家族富含半胱氨酸,半胱氨酸排布模式和其它物种中半胱氨酸排布模式类似,但AAI LTSS、GASA、BBI等超家族中有与其他物种中半胱氨酸排布模式有差异的成员。
GO分析发现,玉米的小分泌蛋白多在信号转导、生殖、与其它生物互作、调节等生物学过程起作用,参与代谢和细胞过程的相对较少。预测参与生殖过程的的小分泌蛋白有RALF、Pollen Ole eI、BAP、SCP、AAI等超家族,占到具有结构域的小分泌蛋白的35%。有的小分泌蛋白的氨基酸序列相似性程度很高;有的小分泌蛋白可以有2-4种转录本编码,这样的小分泌蛋白有93种。玉米小分泌蛋白基因在染色体不同区段的分布密度差异很大,在染色体两端的分布密度高于染色体中部。玉米小分泌蛋白的等电点(PI)差别较大,从3.39到12.40。但在有的超家族中其PI值变化较小,像Knotl、GASA超家族的PI大多在8-9,ML、PLA2 like、PSK超家族则在4-6。
利用qRT-PCR的方法分析了玉米小分泌蛋白BAP、Knotl、DEFL、Pollen Ole eI、SLR、Prolamin、Thioredoxin like、RALF家族成员在生殖器官(幼嫩柱头,成熟柱头,幼嫩子房,成熟子房,幼嫩雄穗和成熟花粉)中的表达,发现这些小分泌蛋白在子房和成熟花粉中的表达量比较高。
分析玉米的小分泌蛋白,发现参与植物生殖的小分泌蛋白往往富含半胱氨酸,在结构上与防御类蛋白(尤其是PDF和DEFL)具有同源性。结合前人的数据,筛选出60个玉米雌雄配子体识别过程中发挥作用的候选小分泌蛋白基因。利用分泌型酵母表达系统表达了其中4个蛋白,grmzm2g039942 p01、grmzm2g046532 p01、grmzm2g397848 p01、grmzm2g483043 p02,蛋白经镍柱吸附,咪唑洗脱和超滤柱纯化后,通过体外花粉管生长实验发现grmzm2g397848 p01可以排斥花粉管,使其生长方向发生改变。