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研究目的:抗磷脂综合征(anti-phospholipid syndrome,APS)等自身免疫性疾病被认为与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生发展有关。其中,APS中主要的免疫复合物β2糖蛋白I/抗β2GPI抗体复合物(β2-glycoprotein I/anti-β2-glycoprotein I antibody complex,β2/aβ2)被证实能够通过TLR4依赖的方式促进AS中的血管内皮炎症和血栓形成。然而,尽管APS患者常伴有血管内膜炎症等病理改变,但其AS的总体发病率并未显著提高。我们猜测,这可能与β2/aβ2复合物和TLR4对内膜下脂质积累的抑制作用有关。为了验证这一设想,我们选择THP-1巨噬细胞作为体外模型,以介导巨噬细胞脂质摄取的CD36和介导巨噬细胞内膜下定植的粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)作为切入点,以此深入分析β2/aβ2复合物对ox LDL引起的巨噬细胞脂质积累与FAK活化的影响,并对TLR4在这一过程中的作用进行探讨。研究方法:(1)利用肝素亲和层析法从健康人混合血浆中提取β2GPI,并采用SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot对所得β2GPI进行鉴定。用提取的β2GPI免疫新西兰大兔,并采用Protein G亲和层析法从经免疫新西兰大白兔的血清中分离抗β2GPI抗体(anti-β2GPI antibody,aβ2),再通SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot对所得aβ2进行鉴定。(2)利用PMA刺激法使THP-1单核细胞分化为THP-1巨噬细胞。随后,对所得THP-1巨噬细胞的形态进行观察,分别采用Western blot和Dil-ox LDL吞噬试验对该细胞的表面标志和吞噬功能进行鉴定。(3)利用RPMI 1640、ox LDL、ox LDL+β2/aβ2、ox LDL+LPS刺激经或未经TLR4阻断剂预处理的THP-1巨噬细胞。通过细胞免疫荧光、Western blot和RT-q PCR检测THP-1巨噬细胞上清道夫受体CD36的表达;通过油红O染色和Trinder胆固醇定量法检测和分析THP-1巨噬细胞内胆固醇积累;通过RT-q PCR检测THP-1巨噬细胞中胆固醇酯化酶ACAT1和胆固醇逆向转运相关蛋白ABCA1和ABCG1的m RNA表达。据此分析β2/aβ2复合物和TLR4对ox LDL引起的CD36活化的影响,以及该影响导致的生物学效应。(4)利用RPMI 1640、ox LDL、ox LDL+β2/aβ2、ox LDL+LPS刺激经或未经TLR4阻断剂预处理的THP-1巨噬细胞。通过细胞免疫荧光、Western blot和RT-q PCR检测THP-1巨噬细胞中FAK的表达和磷酸化;通过Transwell检测THP-1巨噬细胞的逆向迁移能力;通过ELISA检测THP-1巨噬细胞培养上清MMP-2和MMP-9的浓度。据此分析β2/aβ2复合物和TLR4对ox LDL引起的FAK活化的影响,以及该影响导致的生物学效应。(5)利用RPMI 1640、ox LDL、ox LDL+β2/aβ2等刺激经或未经TLR4阻断剂预处理的THP-1巨噬细胞。通过Western blot检测THP-1巨噬细胞中PPAR-γ的蛋白表达;通过ELISA检测THP-1巨噬细胞培养上清中IL-6和TNF-α的浓度;通过细胞免疫荧光检测CD36的亚细胞定位。以此探讨β2/aβ2复合物通过TLR4影响CD36表达和功能的机制。研究结果:(1)经与标准品比较,提取得到的人β2GPI和抗β2GPI抗体生物学活性良好,适用于实验研究。(2)本研究中诱导的THP-1巨噬细胞形态典型,高表达巨噬细胞表面标志,且具有良好的脂质吞噬能力。(3)相比单独的ox LDL,经ox LDL+β2/aβ2处理的THP-1巨噬细胞的CD36表达明显减低,其胞内脂质减少、胆固醇酯比例降低,并伴有胆固醇酯化酶ACAT1的表达降低和胆固醇逆向转运相关蛋白ABCG1的表达增高。此外,在刺激前利用TLR4阻断剂TAK-242预处理可以部分逆转上述差异。(4)相比单独的ox LDL,经ox LDL+β2/aβ2处理的THP-1巨噬细胞的FAK表达和磷酸化明显减低,细胞逆向迁移能力增强,且伴有MMP-2和MMP-9分泌的增多。此外,在刺激前利用TLR4阻断剂TAK-242预处理可以部分逆转上述差异。(5)相比单独的ox LDL,经ox LDL+β2/aβ2处理的THP-1巨噬细胞的PPAR-γ蛋白表达减低,而IL-6和TNF-α的分泌以及CD36的胞质定位则有所增加。此外,在刺激前利用TLR4阻断剂TAK-242预处理可以部分逆转上述差异。结论:(1)β2/aβ2复合物既能促进ox LDL引起的THP-1巨噬细胞炎症反应和MMPs表达,又能抑制该细胞的CD36表达、脂质蓄积和FAK活化,在巨噬细胞的动脉粥样硬化相关改变中起到双重作用。(2)β2/aβ2复合物对THP-1巨噬细胞CD36表达、炎症反应、MMPs分泌、脂质蓄积和FAK活化的作用依赖于TLR4的功能。