【摘 要】
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【目的】CCR5具有广泛的基因多态性,存在明显的人种差异。在中国汉族人群中发现CCR5编码区的单核苷酸多态性,这些突变位点可能导致蛋白构象变化,而使受体的结构和功能发生改变。塞拉维诺是国内首个批准进入临床试验的CCR5拮抗剂,对进行CCR5定点突变体对塞拉维诺的抗HIV-1病毒活性的影响研究,可以为个性化药物疗效提供依据。【方法】首先构建CCR5及其突变体的慢病毒表达载体,利用三质粒系统包装CCR
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【目的】CCR5具有广泛的基因多态性,存在明显的人种差异。在中国汉族人群中发现CCR5编码区的单核苷酸多态性,这些突变位点可能导致蛋白构象变化,而使受体的结构和功能发生改变。塞拉维诺是国内首个批准进入临床试验的CCR5拮抗剂,对进行CCR5定点突变体对塞拉维诺的抗HIV-1病毒活性的影响研究,可以为个性化药物疗效提供依据。【方法】首先构建CCR5及其突变体的慢病毒表达载体,利用三质粒系统包装CCR5及其突变体的慢病毒粒子再感染HOS-CD4细胞;用抗生素G418筛选得到稳定表达CCR5及其突变体的细胞,利用有限稀释法继续筛选后,提取细胞膜蛋白进行western blot鉴定,获得单克隆细胞HOS-CD4-CCR5及其突变株。利用western blot实验和流式细胞术检测HOS-CD4-CCR5及其突变株细胞表面CCR5蛋白的表达量;用ELISA方法定量检测HOS-CD4-CCR5及其突变株细胞对R5嗜性病毒HIV-1SF162的感染力;用实时荧光定量PCR检测塞拉维诺（DC521022）抑制HIV-1SF162进入HOS-CD4-CCR5及其突变体细胞的作用;以ELISA方法捕捉HIV-1 p24抗原检测塞拉维诺（DC521022）抑制HIV-1SF162进入HOS-CD4-CCR5及其突变体细胞的作用。实验均以马拉维诺（MVC）作为阳性对照药物。【结果】（1）成功构建慢病毒表达载体Plvx-IRES-Neo-CCR5及其突变体,经验证均能够成功表达CCR5蛋白。（2）经抗生素的持续筛选和western blot鉴定后,分别获得单克隆细胞HOS-CD4-Plvx 7株、HOS-CD4-CCR5 5株、HOS-CD4-CCR5/503G/T 2株、HOS-CD4-CCR5/668G/A 1株、HOS-CD4-CCR5/Δ894C 7株、HOS-CD4-CCR5/999G/T 4株。（3）与野生型CCR5细胞相比,定点突变体细胞株的CCR5蛋白细胞表面表达量减少。（4）与野生型CCR5细胞相比,定点突变体的细胞株对HIV-1SF162病毒感染力降低。（5）在HIV-1病毒RNA水平,DC521022在100 n M浓度下能有效地抑制HIV-1SF162病毒进入HOS-CD4-CCR5及其突变体细胞;其中在HOS-CD4-CCR5和HOS-CD4-CCR5/668G/A细胞中,DC521022抑制HIV-1SF162病毒效果比相同浓度阳性对照药物MVC更好,而其余CCR5突变体细胞中两药抑制效果相当。（6）在HIV-1病毒p24蛋白水平,DC521022均能有效地抑制HIV-1SF162的进入HOS-CD4-CCR5及其突变体细胞,并且抑制效果与阳性对照药物MVC相当。DC521022和MVC的EC50值在HOS-CD4-CCR5细胞中分别为1.58±1.10 n M、1.85±0.54 n M;在HOS-CD4-CCR5/503G/T细胞中分别为3.23±0.88 n M、2.66±0.03 n M;在HOS-CD4-CCR5/668G/A细胞中分别为2.74±0.02 n M、2.34±0.40 n M;在HOS-CD4-CCR5/Δ894C细胞中分别为0.40±0.04 n M、0.46±0.03 n M;在HOS-CD4-CCR5/999G/T细胞中分别为1.43±0.27 n M、1.33±0.53 n M。【结论】通过构建CCR5及4种定点突变的质粒,筛选得到CCR5及其突变体的单克隆细胞株;检测到这些CCR5突变体能够引起细胞表面CCR5蛋白表达量减少,并使细胞对R5嗜性病毒HIV-1SF162感染力降低;而在CCR5拮抗剂的作用下,DC521022能有效的抑制病毒HIV-1SF162进入HOS-CD4-CCR5及其突变体细胞,抑制作用优于MVC或与之相当;并且CCR5定点突变对CCR5拮抗剂DC521022、MVC都没有产生明显的耐药性,而Δ894C突变体能显著提高DC521022、MVC的抗HIV-1作用。
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