目的:肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS),是一种致残性、致死性的神经变性疾病,表现为上、下运动神经元损害、运动功能丧失的临床症状和神经电生理表现,在疾病终末期出现呼吸功能衰竭,最终导致患者死亡。目前该疾病病因未明,关于其发病存在较多假说,现阶段普遍接受的是谷氨酸介导的兴奋性神经毒性;同时,谷氨酸介导的兴奋性神经毒性与线粒体功能异常的相关性也不断被证明。本研究建立健脾益肺方预处理、谷氨酸诱导模型,发现健脾益肺方可减少谷氨酸诱导的星形胶质细胞模型谷氨酸兴奋性毒性及提高谷氨酸诱导的PC12细胞模型线粒体功能。方法:1、动物准备、细胞及健脾益肺方冻干粉的制备1.1动物:SD孕鼠,待产,取新生24 h内幼鼠以提取皮层星形胶质细胞;14-16 d胎鼠以提取脊髓前角运动神经元。1.2健脾益肺方冻干粉制备。2、健脾益肺方对谷氨酸诱导星形胶质细胞EAAT2表达的影响培养星形胶质细胞、神经元的原代;健脾益肺方(低浓度0.25 g/L、中浓度0.5 g/L、高浓度1 g/L)预处理星形胶质细胞24 h,谷氨酸(250 μmoL/L)诱导作用4 h建立细胞损伤模型后,采用MTT法检测各组星形胶质细胞存活情况,用IF法和W-b法检测EAAT2的表达,紫外比色法测定各组培养基上清谷氨酸浓度,IF法检测各组培养基上清作用后的神经元存活情况。3、健脾益肺方对谷氨酸诱导PC12细胞线粒体功能损伤的影响培养PC12细胞,健脾益肺方(低浓度0.5 g/L、中浓度1 g/L、高浓度2g/L)预处理24 h,谷氨酸(250 μmoL/L)诱导作用4 h建立PC12细胞损伤模型后,采用MTT法检测PC12细胞存活情况,流式细胞术及免疫荧光法检测PC12细胞线粒体膜电位,细胞内ROS,钙离子浓度。结果:1、星形胶质细胞和神经元细胞的鉴定与培养传至第三代的星形胶质细胞所占比例为96%以上。培养至6 d的脊髓神经元所占比例为90%以上。2、健脾益肺方对谷氨酸诱导星形胶质细胞EAAT2表达的影响2.1、谷氨酸组、健脾益肺方(低、中、高浓度)预处理组、正常组星形胶质细胞存活率分别是68%、78%、83%、86%、100%;2.2、免疫荧光测定谷氨酸组、健脾益肺方(低、中、高浓度)预处理组、正常组EAAT2表达平均光密度分别是0.61、0.69、0.79、0.87、0.94;蛋白免疫印迹法测定EAAT2的表达提示健脾益肺方干预后EAAT2蛋白表达明显提高(P<0.05,P<0.01)。2.3、测定各组星形胶质细胞培养基上清谷氨酸浓度提示健脾益肺方预处理组培养基上清谷氨酸浓度下降,差异显著具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。2.4、谷氨酸组、健脾益肺方(低、中、高浓度)预处理组、正常组上清作用于神经元后,各组神经元存活个数分别是72.67、92.33、133.67、143.33、160.67个。3、健脾益肺方对谷氨酸诱导PC12细胞线粒体功能损伤的影响3.1、健脾益肺方对谷氨酸诱导PC12细胞活力的影响 与正常组比较,谷氨酸造模组细胞存活率明显降低(P<0.01);与造模组比较,健脾益肺方预处理24 h后,从0.5 g/L开始,细胞存活率随浓度升高而提高,至4 g/L最佳,8 g/L开始降低,其中2、4、8 g/L各处理组之间差异无统计学意义(P>0.05),对比与正常组也无统计学意义(P>0.05),16 g/L组显示高浓度的健脾益肺方对细胞反而有毒性作用。3.2、检测健脾益肺方对谷氨酸诱导PC12细胞线粒体膜电位、ROS、胞内钙离子浓度提示健脾益肺方预处理可提高PC12细胞膜电位(P<0.01),降低细胞内ROS产生和抑制钙离子内流。结论:1、在相应剂量范围内,健脾益肺方可减少谷氨酸兴奋性毒性对星形胶质细胞的损伤,提高EAAT2的表达,降低细胞外液谷氨酸浓度,减少谷氨酸对神经元细胞的损伤,从而起到保护神经元的作用。2、在相应剂量范围内,健脾益肺方可稳定PC12细胞线粒体膜电位,减少胞内活性氧ROS的产生,维持细胞内钙离子浓度,从而减少对PC12细胞的细胞毒性损伤。