传染性法氏囊病病毒(IBDV)是属于Birnaviridae家族的双链RNA病毒。自噬是真核细胞的死亡方式之一。有研究表明,IBDV可以引起DF-1细胞自噬,但其具体机制仍有待研究。MDA5为模式识别受体家族中的一员,能够特异性识别双链RNA病毒。课题组前期研究显示,IBDV能够激活雏鸡法氏囊内鸡MDA5(chMDA5)信号通路,参与IBDV感染雏鸡过程。因此,本试验以IBDV为致病原,鸡胚成纤维细胞(CEF)为研究对象,对MDA5与IBDV引起的自噬之间的关系进行研究,进一步揭示IBDV致病机制。首先,将双链RNA病毒模拟物poly(I:C)转染至CEF,采用Western blot方法对CEF内chMDA5蛋白表达进行检测,结果发现poly(I:C)转染能够引起CEF内chMDA5的表达升高。之后将CEF分为对照组、poly(I:C)组、chMDA5 siRNA+poly(I:C)组、Rapa+poly(I:C)组、3-MA+poly(I:C)组,采用Western blot方法对细胞内自噬标志蛋白LC3表达进行检测,结果显示chMDA5介导poly(I:C)引起CEF的自噬,并且自噬激活剂Rapa能够增加poly(I:C)引起的自噬,而自噬抑制剂3-MA能够抑制poly(I:C)引起的自噬。在此基础上,为研究chMDA5在IBDV感染致CEF自噬中的作用,将CEF分为正常对照组、IBDV感染组、chMDA5 siRNA+IBDV组、Rapa+IBDV组、3-MA+IBDV组,通过Western blot法、间接ELISA法、实时荧光定量PCR法及透射电镜技术检测细胞自噬的发生、MDA5及其信号通路的活化、IBDV的复制及CEF的损伤。结果发现:(1)与正常组相比较,IBDV组chMDA5及其信号通路关键分子chIPS-1、chNF-κB、chIRF3和下游产物chIL-1β、chIL-6、chTNF-α、chIFN-β的表达量极显著升高(P<0.01)。与IBDV组相比较,随着chMDA5的沉默,chIPS-1、chNF-κB、chIRF3及chIL-1β、chIL-6、chTNF-α、chIFN-β的表达量也显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01);Rapa+IBDV组chIL-1β、chTNF-α表达显著性降低(P<0.05),3-MA+IBDV组chMDA5及chIPS-1、chIRF3、chIL-1β、chIL-6、chTNF-α、chIFN-β表达均显著性降低(P<0.05)。(2)与正常组相比较,IBDV组自噬蛋白LC3与Beclin1的表达均极显著地升高(P<0.01),AKT与mTOR磷酸化水平显著性降低(P<0.05)。与IBDV组相比较,将chMDA5特异性沉默后LC3与Beclin1的表达均差异显著地升高(P<0.05),AKT与mTOR的磷酸化水平差异显著性降低(P<0.05);Rapa+IBDV组LC3表达水平、AKT和mTOR的磷酸化水平差异显著或极显著的上升(P<0.05或P<0.01);3-MA+IBDV组与IBDV组相比较,LC3与Beclin1的表达差异显著或极显著的降低(P<0.05或P<0.01)。IBDV组细胞线粒体及内质网肿胀,可见有自噬体。chMDA5 siRNA+IBDV组细胞内线粒体嵴断裂、溶解,内质网肿胀,核周间隙变宽,自噬体结构增多。(3)chMDA5 siRNA+IBDV组及Rapa+IBDV组的病毒滴度、载量及VP2表达显著高于IBDV感染组,3-MA+IBDV组病毒的滴度及VP2表达则极显著降低(P<0.01)。上述结果表明,IBDV感染CEF后,不仅可以激活细胞内MDA5信号通路,还可能通过AKT/mTOR途径失活引起CEF发生自噬;同时,自噬能够促进IBDV的增殖,而MDA5可减弱IBDV所引起的CEF自噬,对CEF产生保护作用。本研究为进一步探讨病毒与自噬的关系以及MDA5通路参与IBDV致病机制奠定基础,为防治病毒性疾病提供了新思路。