论文部分内容阅读
猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)是引发猪断奶后多系统衰弱综合征的主要病原。PCV-2 ORF2编码的结构蛋白具有型特异性抗原决定簇，因此它是区分PCV-1和PCV-2的重要抗原。 根据已发表的PCV-2 ORF2基因序列，设计合成一对引物，经PCR方法扩增出了702bp的基因片段。将该基因片段插入到pGEM-T-Easy载体中，经酶切和测序鉴定，证明成功克隆了PCV-2ORF2基因。 利用分子生物学软件对PCV-2 ORF2基因进行分析后，用PCR方法扩增了10个ORF2基因片段并插入原核表达载体pGEX-4T-1中，经酶切和PCR鉴定，证明成功构建了10个pGEX-PCV2 ORF2基因片段的重组表达质粒。分别将各个重组表达质粒转化E.coli ER2566感受态细胞，经终浓度为1mmol/L的IPTG诱导，PCV-2 ORF2编码的蛋白片段在大肠杆菌E.coli ER2566中以包涵体的形式得到大量表达。Western-blot免疫印迹表明，表达的10个重组蛋白中有9个能被PCV-2的单克隆抗体所识别。 用含有2mol/L、4mol/L和8mol/L尿素的包涵体洗涤液多次洗涤包涵体后，用电洗脱方法对各个重组蛋白进行纯化，获得了理想的纯化效果。 用纯化的各个重组蛋白建立了间接ELISA方法，并用建立的ELISA方法对PCV-2的攻毒猪进行抗体检测，结果表明有6个表达抗原具有良好的反应原性。