论文部分内容阅读
背景哮喘是儿童和青年人群中最常见的慢性疾病之一,近年来我国儿童的哮喘患病率呈现不断上升的趋势。哮喘的发病受诸多因素影响,其中妊娠期母亲烟草烟雾暴露是最常见的诱发因素之一。妊娠期是子代组织器官发育的关键时期,研究显示,F0代妊娠期烟草烟雾暴露可能通过跨代遗传的方式增加F1代、F2代和F3代发生哮喘的风险,但其机制目前尚不清楚,故研究妊娠期烟草烟雾暴露对后代发生哮喘的影响及机制具有重要意义。目的本课题的目的是通过采用BALB/c小鼠妊娠期烟草烟雾暴露模型,研究F0代雌鼠妊娠期烟草烟雾暴露导致后代发生哮喘的跨代遗传效应。具体而言,通过考察妊娠期烟草烟雾暴露小鼠F1代、F2代和F3代支气管肺泡灌洗液及细胞计数和小鼠脾组织中Th1/Th2型细胞因子的变化,以期明确后代哮喘易感性的变化;另外探索F1代、F2代和F3代小鼠Th1/Th2型细胞特异性转录因子T-bet和GATA-3蛋白表达的变化,进一步研究跨代遗传的可能分子机制。方法1.BALB/c小鼠哮喘模型的制备烟草烟雾暴露组仔鼠用OVA(卵清蛋白)致敏液腹腔注射致敏,对照组仔鼠用PBS溶液代替致敏液腹腔注射进行致敏,制备哮喘模型。2.支气管肺泡灌洗液制备及细胞计数取各组小鼠,麻醉后切开气管,插管、固定。注入1mL预冷无菌PBS液,回收支气管肺泡灌洗液。测定细胞总数并计数嗜酸性粒细胞。3.细胞因子水平检测3.1脾脏单核细胞悬液中细胞因子IL-4和IFN-γ水平对照组与烟草烟雾暴露组小鼠均于末次雾化后在无菌条件下剖开腹腔取脾,研磨制备脾细胞悬液,处理后取上清液,使用小鼠细胞因子免疫酶联试剂盒分别检测IL-4和IFN-γ细胞因子水平。3.2外周血清中细胞因子IL-4和IFN-γ水平对照组与烟草烟雾暴露组小鼠均于末次雾化后摘除眼球收集血液,获得血清样品,使用小鼠细胞因子免疫酶联试剂盒分别检测IL-4和IFN-γ细胞因子水平。4.肺组织转录因子表达水平检测对照组与烟草烟雾暴露组小鼠均于末次雾化后取肺组织,采用Western blotting法检测转录因子GATA-3和T-bet的蛋白表达水平,观察母系妊娠期暴露对后代转录因子表达水平是否有影响。结果1.小鼠哮喘模型症状分析烟草烟雾暴露组的F1代、F2代和F3代小鼠在以20μg/mL的OVA溶液雾化激发后,均表现出体毛直立、抓挠口鼻、身体发抖、呼吸加快、步履蹒跚、盲目跳跃等症状,符合哮喘模型制备标准,据此判断烟草烟雾暴露组小鼠过敏反应强阳性,而阴性对照组行为未见异常。2.支气管肺泡灌洗液细胞总数及分类计数与对照组相比,烟草烟雾暴露组F1代、F2代和F3代小鼠支气管肺泡灌洗液细胞总数、中性粒细胞计数、嗜酸性粒细胞计数和淋巴细胞计数均显著高于对照组(P<0.05),且随着代次增加,呈现出减弱趋势。3.脾脏单核细胞混悬液中细胞因子的水平3.1脾脏单核细胞悬液中细胞因子IL-4和IFN-γ水平与对照组相比,烟草烟雾暴露组F1代、F2代和F3代小鼠脾脏单核细胞悬液中细胞因子IL-4水平分别为80.42±5.52 ng/L、64.84±2.89 ng/L和8.44±0.60 ng/L,均显著高于对照组(4.32±0.59 ng/L,P<0.05),且随着代次增加而下降,与F1代相比,F3代小鼠细胞因子IL-4水平显著降低(P<0.01)。烟草烟雾暴露组F1代和F2代小鼠细胞因子IFN-γ水平分别为23.87±2.99 ng/L和35.69±3.00 ng/L,均显著低于对照组(46.53±3.76 ng/L,P<0.01),且F3代IFN-γ水平(42.48±5.35 ng/L)显著高于F1代(P<0.05),但F3代与对照组无显著性差异(P>0.05)。3.2外周血清中细胞因子IL-4和IFN-γ水平与对照组相比,烟草烟雾暴露组F1代、F2代和F3代小鼠外周血清中细胞因子IL-4水平分别为42.77±5.26 ng/L、36.66±5.81 ng/L和23.04±3.88 ng/L,均显著高于对照组(15.27±0.45 ng/L,P<0.05),且随着代次增加而下降,与F1代相比,F3代小鼠细胞因子IL-4水平显著降低(P<0.01)。烟草烟雾暴露组F1代和F2代小鼠细胞因子IFN-γ水平分别为47.40±5.06 ng/L和56.66±8.02 ng/L,均显著低于对照组(59.97±4.80 ng/L,P<0.05),且F3代IFN-γ水平(61.88±9.78 ng/L)显著高于F1代(P<0.05),但F3代与对照组无显著性差异(P>0.05)。4.肺组织转录因子表达水平检测烟草烟雾暴露组F1代、F2代和F3代小鼠的肺组织中GATA-3蛋白表达显著高于对照组(P<0.05),而T-bet表达显著低于对照组(P<0.05)。结论1.妊娠期烟草烟雾暴露,可导致后代接触过敏原后,哮喘发生的风险增加。2.妊娠期烟草烟雾暴露可改变免疫系统转录因子表达,并表现出跨代遗传的特征。