塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶及柚皮果胶提取工艺研究

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果胶酯酶(pectin esterase,PE)对聚半乳糖醛酸甲酯具有高度专一性,能够去除果胶中的甲氧基,提高果胶溶解度。在果蔬加工、酿酒、纺织、茶饮料、造纸、医药及化妆品行业等生产工艺中,已广泛利用果胶酯酶的活性来改善产品品质,尤其是在低酯果胶制备上效果显著。目前对果胶酯酶发酵的研究较少,有学者研究了黑曲霉产果胶酯酶的发酵技术,而对于塔宾曲霉产果胶酯酶发酵技术的研究则相对更少。本研究以塔宾曲霉CICC 2651为研究对象,对其产果胶酯酶液态发酵最佳培养基组成以及发酵条件进行探索,测定该果胶酯酶的酶学性质,并在酸法提取柚皮果胶的基础上研究其对柚皮果胶的脱酯作用,明确了果胶酯酶对柚皮果胶含有的甲氧基具有良好的水解活性。主要结果如下:首先,以塔宾曲霉CICC 2651为研究对象,以果胶酯酶(PE)活力为主要指标,系统地研究了液态发酵培养基组成和发酵条件对塔宾曲霉CICC 2651产果胶酯酶的影响,初步优化了塔宾曲霉CICC 2651产果胶酯酶的250 mL摇瓶发酵工艺。结果表明,果胶酯酶最适产酶培养基(w/v)为:高酯果胶3%,硫酸铵0.5%,Na2SO4 0.04%,MgSO4·7H2O 0.04%,K2HPO4 0.2%,FeSO4·7 H2O 0.005%,100 mL蒸馏水;最适发酵条件为:初始pH 4.5,接种量5%,装液量40 m L/250 m L,玻璃珠添加量5颗,180 r/min,发酵温度30°C。所产的果胶酯酶酶活达到1.53 U/m L,较优化前提高了1.78倍。其次,利用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow、Seohacryl S-100凝胶柱层析对塔宾曲霉所产果胶酯酶进行分离纯化,并研究了果胶酯酶的酶学性质。结果表明果胶酯酶的最适温度为50°C;在45°C、50°C下保存150 min,果胶酯酶稳定性相对酶活分别为62.5%和36.5%;温度高于45°C,果胶酯酶酶稳定性逐渐降低;在55°C、60°C下保存150 min,相对酶活都低于20%;最适pH为4.0,在pH为3.5~8.0之间果胶酯酶稳定性较好;当金属离子浓度为1 mmol/L时,Cu2+、Ag+对果胶酯酶具有强烈抑制作用,其余金属离子对果胶酯酶促进/抑制作用不显著;当金属离子浓度为10 mmol/L时,Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+、Ag+对果胶酯酶抑制作用显著,Ba2+、Ca2+、Mn2+、Mg2+对果胶酯酶具有抑制作用,而Na+、K+对果胶酯酶无显著影响。采用Lineweaver-Burk双倒数法求出米氏常数Kmax为15.2 mg/mL,最大反应速度Vmax为10.3μmol/(mL·min)。最后,以柚皮粉为原材料,以果胶得率、脱色率为指标,研究了酸法浸提柚皮果胶工艺中浸提温度、pH、浸提时间、液料比对柚皮果胶得率的影响以及脱色剂的种类,脱色时间,温度对柚皮果胶脱色效果的影响。结果表明,浸提时间90 min,浸提液pH1.5,液料比20,浸提温度100°C;选择珍珠岩为脱色剂,添加量为2%,脱色温度为70°C,脱色时间为20 min,果胶浸提液:乙醇为5:4,果胶得率达到11.5%。在酸法浸提柚皮果胶工艺基础上,以果胶得率及甲氧基含量为指标,研究了果胶酯酶的用量及处理时间对柚皮果胶的脱酯影响,发现当酶用量为7.5 U,酶处理时间为50 min时,获得的柚皮果胶甲氧基含量为37.3%,得率为12.2%。
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