影响半夏人工种胚同步化的关键因素研究

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为了获得半夏同步化人工种胚,以半夏叶片为外植体材料,添加不同植物生长调节剂和营养物质进行诱导,筛选适宜疏松愈伤组织诱导的条件,并以疏松愈伤组织为材料进行悬浮培养,最终明确影响人工种胚同步化的关键因素。主要研究结果如下:(1)以半夏叶片为试验材料,研究不同碳源(蔗糖、麦芽糖、葡萄糖)、氮源(蛋白胨、牛肉浸膏、酸性水解酪蛋白)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)对半夏叶片疏松愈伤组织诱导的影响。结果表明:2,4-D对疏松愈伤组织诱导具有显著影响,蔗糖对其影响较小。愈伤组织鲜重随6-BA浓度的升高先上升后下降;30 g·L-1蔗糖处理组愈伤组织鲜重最大;0.4 g·L-1酸性水解酪蛋白处理组愈伤组织质地疏松。综合愈伤组织鲜重和愈伤组织疏松程度的分析,适宜的半夏疏松愈伤组织诱导条件为:MS+1.5 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 2,4-D+20 g·L-1 sucrose+0.4 g·L-1 CH。(2)以半夏疏松愈伤组织为试验材料,研究不同碳源(蔗糖、麦芽糖、葡萄糖)、氮源(蛋白胨、牛肉浸膏、酸性水解酪蛋白)、装液量(30 m L、40 m L、50 m L)、接种量(2 g、3 g、4 g)和不同浓度及种类的植物生长调节剂对半夏悬浮培养细胞增殖的影响。结果表明:蔗糖作为碳源效果最佳,酸性水解酪蛋白为合适的氮源,当装液量为50 m L时愈伤组织鲜重、细胞沉降体积最大,接种量为3 g时细胞活力最强,低浓度2,4-D处理下细胞增殖效果较好,当2,4-D 0.5 mg·L-1、6-BA 1.5 mg·L-1、NAA1.5 mg·L-1细胞增殖倍数最大且活力最强。综合细胞活力、增殖倍数和细胞沉降体积得出适宜半夏悬浮培养细胞增殖的培养条件为:MS+0.5 mg·L-1 2,4-D+1.5 mg·L-1 6-BA+1.5 mg·L-1 NAA+30 g·L-1sucrose+0.4 g·L-1 CH,接种量3 g,装液量为50 m L。(3)以半夏悬浮培养的细胞为试验材料,MS+0.5 mg·L-1 2,4-D+1.5 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1NAA+30 g·L-1 sucrose+0.4 g·L-1 CH为基本培养基,探讨温度、咖啡因、蔗糖浓度对半夏悬浮培养细胞同步化的作用,结果表明温度为8℃,处理12 h,恢复36 h,同步化效果最好,细胞分裂指数为13.86%;咖啡因浓度为2.00 mmol·L-1,处理2 h,恢复48 h,效果较好,细胞分裂指数为9.42%;蔗糖浓度为40 g·L-1,处理5 d,恢复4 d,效果一般,细胞分裂指数为5.33%。(4)以半夏悬浮微细胞团为试验材料,MS+30 g·L-1 sucrose+0.3 g·L-1 CH为基本培养基,研究不同6-BA、IBA浓度和接种量对半夏悬浮微细胞团同步膨大的影响。研究结果表明:影响最大的为6-BA,0.5 mg·L-1 IBA+0.5 mg·L-1 6-BA+接种量3 g时的同步化效果最好。(5)以膨大后微细胞团为试验材料,MS+0.3 g·L-1酸性水解酪蛋白为基本培养基,研究不同6-BA、IBA、蔗糖浓度对半夏悬浮微细胞团同步分化的影响。结果表明:添加0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1IBA+10 g·L-1蔗糖同步分化率最高。本文结果,为深入研究半夏组织培养中疏松愈伤组织的诱导与增殖,特别是种胚同步化的调控奠定了良好的基础,为解决半夏的人工种胚同步化难题提供理论指导,对半夏人工种子产业化具有理论意义。
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