[目的]：　　肾纤维化是各种不同病因的慢性肾病进展到终末期肾衰竭的共同途径和主要病理基础。了解肾纤维化的分子机制，探索有效的防治措施，对延缓肾功能减退，延长患者寿命具有十分重要的意义。已有研究显示，单核-巨噬细胞相关的炎症反应在肾纤维化发生过程中扮演着重要角色，抑制炎症反应可以有效抑制纤维化程度。然而，从抑制炎症反应的角度，查找潜在的抗纤维化药物，目前相关研究较少。垂盆草提取物(SSBE)是一种新发现的具有抗炎功效的中草药，但SSBE是否可以通过抑制单核-巨噬细胞相关的炎症反应，从而达到抗肾纤维化的作用尚待进一步研究证实。　　本研究从体外实验角度，培养大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E，应用不同浓度的马兜铃酸(AA)进行损伤实验，并同时加或不加SSBE进行干预。我们的研究旨在:　　1.阐明AA诱导肾小管上皮细胞NRK-52E损伤，上皮细胞-间充质转化(EMT)发生和细胞外基质(ECM)形成的分子机制。　　2.证实SSBE能抗AA诱导的肾纤维化，并证实其抗肾纤维化作用是通过抑制单核-巨噬细胞相关炎症因子的表达和释放来达到的。　　3.证实SSBE抗单核-巨噬细胞相关的炎症反应是通过抑制核转录因子κB(NF-κB)信号的活化来实现的。　　[方法]：　　将体外培养的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)分为三个实验组:①对照组:未加入SSBE和AA;②AA损伤组:AA浓度为1、10、100mg/L;③SSBE干预组:AA浓度为10 mg/L和SSBE浓度为10、100、1000mg/L。培养24 h后，通过以下方法检测:　　1.采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化;　　2.WST-1测定细胞增殖及毒性的变化;　　3.Hoechst33258染色和流式细胞术检测NRK-52E细胞的凋亡情况;　　4.实时荧光定量PCR(real-time PCR)和Western blot检测凋亡相关基因c-Myc和p53 mRNA和蛋白的表达;　　5.实时荧光定量PCR和细胞免疫荧光染色检测ECM成分Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原，上皮细胞标志物钙黏蛋白(E-cadherin)，肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，及细胞表型转化(EMT)抑制分子骨形态发生蛋白(BMP-7)mRNA和蛋白的表达;　　6.酶联免疫吸附试验(ELISA)和细胞免疫荧光染色检测巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的表达;　　7.实时荧光定量PCR和细胞免疫荧光染色检测单核细胞趋化因子(MCP-1)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的表达;　　8.Western blot检测炎症反应重要信号通路中NF-κB p65的表达。　　[结果]：　　1.AA诱导NRK-52E细胞出现损伤、凋亡、坏死和异常增殖:倒置相差显微镜的观察发现，AA能诱导NRK-52E细胞的损伤;且不同浓度的AA导致的损伤程度不同，Hoechst33258染色结果显示，AA1 mg/L即可诱导细胞出现凋亡小体，AA10 mg/L时细胞凋亡特征最为典型，而当AA高达100 mg/L时则主要表现为坏死。流式细胞术检测也发现，10 mg/L的AA处理24 h后，NRK-52E细胞凋亡率明显增加。同时，real-time PCR和western blot结果也显示，AA作用后，p53和c-Myc mRNA和蛋白的表达增加。WST-1细胞活力和增殖检测结果表明AA损伤NRK-52E细胞呈现时间和浓度的依赖性。　　2.SSBE对AA诱导的细胞增殖和凋亡的影响:SSBE对NRK-52E细胞的作用呈现浓度相关性。倒置相差显微镜观察到，10和100 mg/L的SSBE能明显减轻AA诱导的NRK-52E细胞的损伤，但浓度为1000 mg/L时，SSBE可诱导细胞损伤，增殖的细胞数目明显被抑制。Hoechst33258染色和流式分析显示，10和100 mg/L的SSBE能降低晚期凋亡和坏死细胞的比例，但浓度为1000mg/L时，SSBE可增加早期凋亡细胞比例。　　3.SSBE干预AA诱导的ECM成分的累积:细胞免疫荧光染色结果显示，AA作用24 h后NRK-52E细胞的Ⅲ型胶原蛋白表达明显增多;real-time PCR结果也表明Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA的表达随AA浓度的增加而增高;而SSBE却能抑制Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA和蛋白的高表达。　　4.SSBE干预AA诱导的肾小管上皮细胞EMT的发生:细胞免疫荧光染色和real-time PCR结果表明，10 mg/L的AA作用于NRK-52E细胞24 h后，E-cadherin mRNA和蛋白表达下调，α-SMA mRNA和蛋白表达上调，并且EMT抑制分子BMP-7 mRNA表达下调。而SSBE干预后，上述改变被抑制。　　5.SSBE干预AA诱导的单核-巨噬细胞相关炎症因子的表达:ELISA和细胞免疫荧光染色检测结果表明，MIF的表达随着AA浓度的增高而增加;real-timePCR和细胞荧光免疫染色也观察到MCP-1和M-CSF的表达在AA作用后呈浓度依赖性升高。而AA诱导的MIF、MCP-1和M-CSF这些炎症因子的高表达可被SSBE所抑制。　　6.SSBE抑制AA对NF-kB信号的活化:Western blot检测结果显示，AA作用24 h后，NF-κB p65的表达明显升高，而在浓度为10、100和1000 mg/L SSBE作用后，NF-κB p65的表达则下降。　　[结论]：　　1.AA可诱导肾小管上皮细胞凋亡，并引起异常增殖，发生纤维化样改变。　　2.AA可诱导肾小管上皮细胞发生表型转化(EMT)，形成了表达ECM成分如Ⅰ型和Ⅲ型胶原的肌成纤维细胞。　　3.AA可诱导肾小管上皮细胞单核-巨噬细胞相关的炎症因子MIF、MCP-1和M-CSF的表达和释放。　　4.SSBE抑制AA诱导的EMT转变和ECM累积。　　5.SSBE抑制单核-巨噬细胞相关的炎症因子表达。　　6.SSBE可抑制AA所致的NF-κB信号的活化。