前言糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常见和最严重的慢性并发症之一。在欧洲，DN是肾移植的第2位原因；在美国，35％的肾移植患者是糖尿病人，已成为肾移植的首要原因。DN的治疗花费巨大，愈来愈引起人们的关注。然而，目前对于本病的具体发病机制我们并不清楚。近十年来，大量研究发现血浆中ox-LDL水平与动脉粥样硬化和肾小球硬化的发生相关，提示ox-LDL在DN的进展中发挥着重要作用。研究发现，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）可以驱化炎性细胞聚集并黏附到血管壁，诱导内皮细胞／肾小球系膜细胞凋亡或增殖，有很强的毒性作用。Ox-LDL被其清除性受体清除。随着研究的深入，越来越多的ox-LDL受体不断被人们发现，包括传统的SR-AⅠ／Ⅱ，CD36，SR-B1，CD68和SR-EC。目前大多数受体的功能并不明确。近年来，血凝素样氧化低密度脂蛋白受体（Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor，LOX-1）因特异性地与ox-LDL结合，参与动脉粥样硬化的进展，逐渐引起人们的兴趣。LOX-1是日本学者Tatsuya Sawamural997年使用分子克隆文库的方法在小牛血管内皮细胞中克隆出来的一种新型ox-LDL清除性受体。生理条件下，LOX-1能够清除破损或凋亡的细胞碎片、病原微生物或其他相应物质，在宿主防御中发挥作用。在病理条件下，LOX-1能被像TNF-α、TGF-β1、内皮素、佛波酯醇、血管紧张素Ⅱ、ox-LDL及流体切应力等致炎物质刺激上调，激活内皮细胞，使平滑肌细胞转化，使脂质在巨噬细胞中堆积，在血管的炎性反应和动脉粥样硬化发生发展中发挥重要作用。糖尿病加速动脉粥样硬化的进展，研究发现糖尿病相关的条件，无论是在体内还是体外，均能增强LOX-1的表达。Jono等研究发现糖基化终末产物（AGE）对BLOX-1-CHO细胞有高亲和性；在培养的牛主动脉内皮细胞（BAECs）中，LOX-1与AGE特异性结合，该作用可被BLOX-1抗体抑制，从而提出LOX-1也可以作为AGE的清除性受体。目前，葡萄糖对LOX-1影响的研究还存在分歧。有研究报道，在培养的BAECs中，糖尿病鼠血清加入高浓度的葡萄糖不能改变LOX-1的表达，而另一些学者在体外研究发现人主动脉内皮细胞和单核细胞源性巨噬细胞暴露于葡萄糖后，LOX-1的表达以时间和浓度依赖的方式增加，并促进单核细胞黏附道巨噬细胞，诱导巨噬细胞形成泡沫细胞。而且，葡萄糖对人主动脉内皮细胞表达LOX-1的刺激作用可被抗氧化剂和NF-κB抑制剂、蛋白激酶C抑制剂及致分裂原激活蛋白激酶（MAPK）抑制剂所消除。电泳移动分析数据表明在人主动脉内皮细胞上，高糖增加核蛋白结合到LOX-1基因的NF-κB的调节元件上。该研究结果进一步提示在高糖引起内皮功能异常、单核细胞黏附，乃至最终导致动脉粥样硬化的形成过程中LOX-1起着重要的媒介作用。动脉粥样硬化和肾小球硬化是糖尿病两大主要并发症，尽管动脉粥样硬化被认为是大血管病变，肾小球硬化被认为是微血管病变，10年来的研究积累了大量的证据表明这两种疾病的过程有着诸多的相似之处，如：内皮细胞受损，LDL的羁绊和氧化，招募并激活单核细胞，平滑肌（系膜）细胞增殖，纤维组织形成。此外，它们还有许多相同的致病因素，血糖、AGE和ox-LDL均与糖尿病心血管病变和肾病的发生相关。它们如此相似，以致有学者将“肾小球硬化”称之为“肾小球动脉粥样硬化”。尽管目前LOX-1在动脉粥样硬化过程中的作用研究备受学者青睐，但它在DN中的作用及其机制目前还没有相关报告。肾小球系膜细胞是肾脏病变的主要效应细胞之一，在DN的发生发展中起着关键性的作用。大量研究发现，肾小球系膜细胞在病变初期即发生增殖，并分泌大量细胞因子，影响细胞外基质合成、分解平衡，逐渐引起细胞外基质（extracellular matrix，ECM）大量沉积，导致肾小球硬化、肾衰的发生。包括血糖、血脂在内的许多致病因素影响肾小球系膜细胞的功能。糖尿病时，转化生长因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）在病变肾脏局部可以由受累的肾小球系膜细胞持续分泌增多，参与胞外基质堆积、肾小球硬化的形成，被认为是肾脏损伤中的关键性介质。许多研究发现，ox-LDL和高糖可以刺激系膜细胞大量表达TGF-β1。本实验首先分别用ox-LDL和D-葡萄糖与正常人肾小球系膜细胞（HGMCs）共同孵育，研究了不同时间和不同浓度下LOX-1、TGF-β1的表达情况，并探讨了LOX-1在TGF-β1表达中的作用，接下来又研究了糖尿病大鼠模型不同时期肾脏LOX-1和TGF-β1的表达情况，及其与血糖、血脂、24小时尿微量白蛋白量的相关性，以期了解LOX-1在DN发生发展中的作用及其机制。3-羟基3-甲基戊二酸辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂（他汀类药物）的问世被喻为心肾保护的里程碑。它除了降低总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇之外，还可能通过其它机制发挥心肾保护功能，本实验还研究了阿托伐他汀（Atorv）对人肾小球系膜细胞和糖尿病大鼠在不同时间肾脏表达LOX-1和TGF-β1的影响，以期了解他汀类药物肾脏保护作用的机制。材料与方法1．人肾小球系膜细胞培养及鉴定取因肾肿瘤行单侧肾切除者正常部分肾皮质，充分切碎呈半糊状，通过100目和200目尼笼筛网滤过，将200目尼笼筛网上的肾小球经0.6mg／mlⅣ型胶原酶消化后进行原代培养，7-10天后传代。细胞传二代后，爬片培养，用细胞免疫化学方法染色检验胞浆内肌动蛋白、结蛋白，角蛋白的染色情况，鉴定肾小球系膜细胞，并用油红“O”染色，证明HGMCs吞噬ox-LDL。4-10代细胞用于实验。2．HGMCs接种在200ml培养瓶中，待细胞接近于融合时，用不完全培养基同步24小时后，换用完全培养基。加入ox-LDL或D-葡萄糖，分别培养6、12、24、48小时。加入不同浓度的ox-LDL或D-葡萄糖，继续培养24小时。加入JTX92（10μg／ml）或Atorv预处理30min，然后加入ox-LDL或D-葡萄糖，继续培养24小时。用RT-PCR和／或Western法检测所收集细胞的LOX-1、TGFβ1和p38MAPK水平，用ELISA法测定细胞培养液上清中的TGFβ1含量。3．建立糖尿病大鼠的动物模型36只12周龄的健康雄性Wistar大鼠，体重200-250mg，随机选取10只作为对照组，试验组26只。试验组中26只鼠尾静脉注射STZ（0.1M柠檬酸盐缓冲液pH4.5溶），按50mg／Kg。给药，建立糖尿病模型；10只对照鼠尾部注射柠檬酸盐缓冲液。3天后检测鼠尾血糖，确定是否造模成功，如血糖未达到16.7mmol／L，再补注一次。26只糖尿病大鼠随机分为2组，13只阿托伐他汀灌胃（15mg／Kg／d），另13只仅生理盐水灌胃。为预防大鼠死亡，两组大鼠皮下注射2-4U／d长效胰岛素。第4周和第8周时各组分别处死6只大鼠，同时留24小时尿检测微量白蛋白量，采血测定其血脂、血糖、HbA1c。取双肾去包膜，冻存于液氮中用于半定量RT-PCR和Western印迹法检测LOX-1、TGFβ1和p38MAPK含量。4．MTF法细胞接种于96孔板，正常培养基生长3天，弃去培养基，PBS冲洗后，加入1％RPMI1640培养基继续培养24h，留置空白和对照组，各实验组分别加入1.2mg／dl、6mg／dl、12mg／dl的阿托伐他汀预处理30min，暴露于终浓度为80μg／dl的ox-LDL中24小时后，每孔加入MTT 20μl（5g／l），继续培养4小时后去除上清，然后每孔加入DMSO 150μl，轻轻振摇，约30min后在492nm波长的酶标仪上测其A值并计算抑制率。5．半定量RT-PCR用Trizol（Invitrogen）常规提取细胞和肾皮质的总RNA，经氯仿处理，异丙醇沉淀，75％乙醇洗涤后，略干燥，溶于50μlDEPC处理水，经核酸紫外分析仪检测A260／A280值（1.75-1.9），并计算出RNA的含量。取各组细胞RNA2μg，加入20URNase抑制剂（TaKaRa），经65℃5min变性后置于冰上，用AMV酶（TaKaRa）在10μl体系中逆转录成cDNA（该体系中含有10×RTbufferlμl，10mMdNTP 1μl，RNase in10U，AMV2.5U，oligdT 12.5pmol，10mM MgCl₂ 2μl）。逆转录条件为42℃60min，然后98％10min灭活逆转录酶，置于冰浴。各取产物5μl，用Taq DNA多聚酶（TaKaRa）和引物在25μl体系中进行PCR（体系中含有5×PCR buffer 5μl，Taq 0.625U，各种引物12.5pmol，10mmol／L MgCl₂ 1μl）。取10μlPCR产物，加2μl 6×溴酚蓝上样液，于1.5％琼脂糖凝胶上以5V／cm的稳定电压下进行电泳。用数码凝胶图像定量分析系统成像和条带密度扫描，用同一标本的GAPDHmRNA或β-ac-tinmRNA作为内参进行校正，计算LOX-1mRNA和TGFβ1mRNA的相对表达量。6．Western印迹提取Trizol细胞裂解产物中的蛋白质成分。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。变性后，取40μg蛋白质加入上样缓冲液，在10％SDS-PAGE电泳至溴酚蓝达到分离胶底部时，用BIO-RAD电极将蛋白质转至PVDF膜上。用含5％去脂奶糖的TTBS封闭膜上免疫球蛋白结合位点2h，加LOX-1单克隆抗体（1：3000）和p38MAPK单克隆抗体（1：3000），4℃过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗（1：1000）孵育2h，在自动电泳凝胶成像分析以上采集图像，并对杂交带整合灰度值进行测定和结果分析。7．ELISA法检测细胞培养液上清中TGFβ1蛋白留取细胞培养上清，稍事离心后冻存于-80℃。用ELISA试剂盒检测各组培养液中的TGFβ1浓度。由于培养上清中TGFβ1水平较低，将一抗孵育时间延长一倍，其余操作按照说明书进行。8．统计学方法所有数据用均以（?）±S表示，组间比较用方差分析，并用post hoc Scheffe’s F进行检验，用Pearson相关分析检验糖尿病组8周大鼠尿微量白蛋白量，血甘油三酯、胆固醇、血糖、HbA1c与LOX-1mRNA的相关性。采用SPSS13.0统计软件。结果1．相差显微镜观察发现生长活跃的人肾小球系膜细胞（HGMC）体积大，常为梭形、不规则星型或三角形、树枝状；细胞边界不清楚，常有融合趋势，可形成多核巨细胞，细胞内有大量为细胞中轴平行的微丝；当细胞密集时可重叠生长。细胞传二代后，消化后的细胞爬片培养，DAB染色发现胞浆内肌动蛋白、结蛋白为阳性；角蛋白为阴性，鉴定为肾小球系膜细胞。油红“O”染色，细胞内可见红色吞噬颗粒，证明HGMCs吞噬ox-LDL。2．ox-LDL（80μg／ml）孵育HGMCs，LOX-1mRNA和蛋白的表达从6h开始逐渐增加，24h达到高峰，48h略有下降，考虑与细胞凋亡有关；10μg／ml ox-LDL即有刺激HGMCs表达LOX-1的作用，80μg／ml ox-LDL能力最强（P＜0.01）。LOX-1特异性阻滞剂JTX92（10μg／ml）可以显著抑制LOX-1的表达（P＜0.01）。由此可见，在24h内ox-LDL以时间和浓度依赖的方式增加HGMCs LOX-1mRNA和蛋白的表达。3．ox-LDL（80μg／ml）孵育HGMCs，TGF-β1mRNA的表达从6h开始增加，24h达到平台期，48h表达水平稍有下降，考虑与细胞凋亡有关。10μg／ml ox-LDL即可HGMCs上调TGF-β1mRNA的表达，80μg／ml组作用最强，上调达4.5倍（P＜0.01）。LOX-1特异性阻滞剂JTX92（10μg／ml）可以明显抑制TGF-β1mRNA表达和蛋白分泌（P＜0.01）。在24h内ox-LDL以时间和浓度依赖的方式增加HGMCs TGF-β1m RNA的表达，JTX92对其具有抑制作用。4．ox-LDL（10-80μg／ml）以浓度依赖的方式增加HGMCs内p38MAPK蛋白的表达，其中，80μg／ml组作用最显著，上调达4.0倍（P＜0.01）。JTX92（10μg／ml）可以显著抑制p38MAPK蛋白的表达，抑制率达45％（P＜0.01）。5．阿托伐他汀（1.2-12μg／ml）对人肾小球系膜细胞的增殖具有明显的抑制作用，抑制率分别为6.4％、22.5％、61.5％，呈剂量依赖方式。6．Atorv（6μg／ml和12μg／ml）可以明显对抗ox-LDL（80μg／ml）引起的HGMCs LOX-1 mRNA表达增加，分别下调14.5％和48.6％，其能力与剂量相关。7．Atorv（6μg／ml和12μg／ml）对ox-LDL（80μg／ml）引起的p38MAPK蛋白活性增加有明显的对抗作用，表达分别下调11.3％和37.1％（P＜0.01），呈剂量依赖性。8．D-葡萄糖（600mg／dl）孵育HGMCs，LOX-1的表达从12h开始增加，48h达到高峰。300mg／dl D-葡萄糖可以刺激HGMCs LOX-1表达，但600mg／dl D-葡萄糖作用最强（P＜0.01）。JTX92（10μg／ml）可以抑制D葡萄糖诱导的LOX-1的表达（P＜0.05）。由此可见，D-葡萄糖以时间和浓度依赖的方式增加HGMCs LOX-1mRNA和蛋白的表达。9．D-葡萄糖（600mg／dl）孵育HGMCs，12h TGF-β1mRNA的表达和蛋白分泌开始明显增加，48h作用最强（P＜0.01）。600μg／ml组D-葡萄糖刺激HGMCs表达TGF-β1能力最显著（与对照组比较，P＜0.01）。JTX92（10μg／ml）可以明显对抗D-葡萄糖刺激HGMCs表达TGF-β1（与D-葡萄糖600 mg／dl组比较，P＜0.01）。可见，D-葡萄糖以时间和浓度依赖的方式增加TGF-β1mRNA的表达和蛋白分泌。10．D-葡萄糖（600mg／dl）以时间依赖的方式激活p38MAPK信号通路，48h可达对照组的3.6倍。D-葡萄糖（100-600 mg／dl）孵育HGMCs24小时，以浓度依赖的方式激活p38MAPK信号通路，600mg／dl D-葡萄糖的作用最显著，上调2.64倍（P＜0.01）。JTX92（10μg／ml）对D-葡萄糖引起的p38MAPK活性增加有明显的对抗作用，下调12.3％（P＜0.01）。11．4周和8周时，糖尿病组和治疗组大鼠体重相对于正常对照组均有显著下降（4周，p＜0.01；8周，p＜0.01），糖尿病组和治疗组间无显著差异（p＞0.05）。糖尿病组和治疗组的血糖、HbA1c相对于正常对照组均有显著增高（4周p＜0.01，8周p＜0.01），糖尿病组和治疗组间无显著差异（p＞0.05）。治疗组的血胆固醇水平相对于糖尿病组有明显下降（4周p＜0.05，8周p＜0.05）。糖尿病组24h尿白蛋白量相对于正常对照组有显著增高（4周，p＜0.01；8周，p＜0.01），糖尿病组和治疗组存在明显差异（8周，p＜0.05）。12．所检样本肾皮质中，糖尿病组LOX-1mRNA和蛋白的相对含量相对于正常对照组显著增高（4周p＜0.01，8周p＜0.01），治疗组较糖尿病组显著降低（4周p＜0.01，8周p＜0.01）。13．所检样本肾皮质中，糖尿病组TGF-β1mRNA的相对含量相对于正常对照组显著增高，4周为正常对照组的3.1倍（p＜0.01），8周为正常对照组的3.25倍（p＜0.01）；8周较4周增高显著（p＜0.01）；治疗组较糖尿病组显著降低，4周表达下调36％（p＜0.01），8周表达下调31％（p＜0.01）。14．所检样本肾皮质中，糖尿病组p38MAPK蛋白的相对含量相对于正常对照组显著增高，4周增高2.94倍（p＜0.01），8周增高4.02倍（p＜0.01）；8周较4周增高显著；治疗组较糖尿病组显著降低，4周其表达下调41.7％（p＜0.01），8周时下调9.6％（p＜0.01）。15．经相关分析后发现，糖尿病大鼠的血糖（r=0.619，p＜0.01）、HbA1c（r=0.828，p＜0.01），血脂(r_TC=0.589，p＜0.01，r_TG=0.430，p＜0.05)、24小时尿微量白蛋白含量（r=0.801，p＜0.01）与糖尿病大鼠肾皮质LOX-1mRNA相对含量相关。结论1．在24小时内ox-LDL以时间和浓度依赖的方式引起人肾小球系膜细胞LOX-1和TGFβ1表达上调，在48小时稍有降低，考虑与细胞凋亡有关。LOX-1特异性抗体JTX92（10μg／ml）阻止ox-LDL的作用，提示LOX-1可能介导ox-LDL引起的TGFβ1表达上调。2．ox-LDL以浓度依赖的方式激活p38MAPK信号途径，LOX-1特异性抗体JTX92（10μg／ml）阻止ox-LDL的作用，提示ox-LDL可能通过与LOX-1结合激活胞内p38MAPK途径，引起系膜细胞合成并分泌大量TGFβ1，引起肾脏病变的发生发展。3．Atorv抑制ox-LDL（80μg／ml）激活的p38MAPK信号途径，抑制细胞增殖，对抗ox-LDL引起的LOX-1m RNA表达上调，从而在预防和治疗伴有血脂异常的糖尿病肾脏病变的发生发展中发挥重要作用。4．D-葡萄糖能以时间和浓度依赖的方式增加LOX-1基因和蛋白水平的表达，并刺激人肾小球系膜细胞合成并分泌大量TGF-β1。D-葡萄糖通过激活细胞内的p38MAPK信号传递系统，上调LOX-1mRNA表达和蛋白的合成，参与糖尿病肾病的发生发展。5．糖尿病大鼠在4周和8周肾皮质LOX-1mRNA和蛋白表达上调、TGFβ1mRNA表达上调，p38MAPK途径被激活。阿托伐他汀可能通过对抗p38MAPK途径激活，抑制TGFβ1基因表达，降低LOX-1的表达，从而预防和治疗糖尿病肾病的发生发展。