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研究背景胰腺癌是临床上预后最差的恶性肿瘤之一,起病隐匿,不易早期发现和诊断,许多病人在确诊时已属中晚期,丧失了手术治疗的时机。化疗作为胰腺癌切除术后和丧失手术机会的患者的一种重要治疗手段,能够提高患者的生存期。但胰腺癌组织存在纤维包裹,组织间压力高,极大减少了肿瘤局部的化疗药物渗透,显著抑制化疗疗效,降低了化疗药物对胰腺癌细胞的杀伤作用。超声化疗(sonochemotherapy)是一种利用低强度超声激励超声微泡造影剂空化,形成暂时性声孔,提高血管壁及细胞膜的通透性(即声孔效应),从而增加肿瘤局部化疗释药的超声治疗技术。但目前超声化疗的最佳声学参数,特别是机械指数(Mechanical Index,MI)仍未达成共识,显著影响了诊断超声联合微泡增强肿瘤化疗的临床转化。为此本研究从体外细胞实验、声学参数测量以及在体的动物实验三个部分对超声联合微泡增敏胰腺癌化疗进行探索,以期能够研究出最佳MI(峰值负压相关参数)来增强胰腺癌的血流灌注,提高肿瘤局部的化疗药物浓度,增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。目的1.探讨占空比相同时,不同声压的低强度超声联合微泡对PANC-1细胞凋亡率的影响。2.测量超声诊疗一体机与空化调节相关的声学参数。3.探讨不同MI的诊断超声联合微泡对裸鼠胰腺癌移植瘤化疗效果的影响。材料和方法一、低强度超声联合微泡对PANC-1细胞凋亡率影响的研究1.实验材料1.1仪器:新型数字化超声声孔仪(DCT-700型,由深圳市威尔德医疗电子有限公司生产),治疗探头为圆形单晶片、非聚焦换能器,探头直径为2.5cm,发射频率是1.0MHz。1.2细胞系:人源胰腺癌细胞系PANC-1细胞。1.3实验试剂:声诺维超声造影剂(注射用六氟化硫微泡)。2.实验方法:分为A-H共8个实验组,每组设定3个平行副孔,实验重复2次。A-H组分别为对照组,单纯微泡组,低、中、高声压组,低、中、高声压联合微泡组。低、中、高声压对应的实测峰值负压分别为1019KPa、1785KPa、2184KPa。各组所使用的其它声学参数均一致:探头中心频率为1MHz,脉冲重复频率(Pulse repetition frequency,PRF)=400Hz,占空比为4%。治疗时间120s。按(4-9)×10~5/孔的细胞密度接种于孔板,培养24h后,按分组分别处理。继续培养24h后收集每孔的细胞送样,使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。3.测量指标PANC-1细胞的凋亡率。二、超声诊疗一体机VINNO70相关声学参数的测量1.实验材料1.1测量对象:超声诊疗一体机VINNO70(飞依诺科技有限公司,苏州),该仪器配有VFLASH超声空化模块,可调节与微泡空化相关的多组参数,包括MI、频率、脉冲宽度(Pulse length,PL)、PRF和发射间歇时间等。1.2测量空化调节相关声学参数的仪器:ONDA薄膜水听器,示波器等。2.实验方法水听器法测量X4-12L线阵探头在VFLASH模式下的中心频率、PL、PRF和不同MI对应的峰值负压实测值以及探头的声场分布。3.测量指标测量并评价仪器标定的空化调节的声学参数与真实测量值之间的关系。三、诊断超声联合微泡增敏裸鼠胰腺癌化疗的研究1.实验材料1.1超声诊疗一体机VINNO70(飞依诺科技有限公司,苏州),本实验主要研究参数:中心频率4MHz,PRF=50Hz,脉冲/间歇时间0.48s/2s,PL=18个cycle,MI分别为:A组:MI=0.3;B组:MI=0.7;C组:MI=1.1;高效液相色谱仪(Waters公司生产);小动物活体荧光成像系统。1.2实验动物:48只健康雄性裸鼠,4周龄大,由陆军军医大学第二附属医院实验动物中心提供。1.3实验试剂:盐酸阿霉素(湖北中龙集团);“脂氟显”微泡造影剂,由陆军军医大学第二附属医院超声科自行研发,外层为磷脂外膜,核心气体为全氟丙烷,平均粒径为2.0um,浓度为2-9×10~9/ml。荧光染料DiR。2.实验方法裸鼠双侧后腿注射PANC-1细胞悬液,成功建立48只裸鼠人胰腺癌荷瘤模型,随机分为A、B、C三组,每组样本量均为16只。荷瘤裸鼠麻醉后取仰卧位固定于操作台上,建立尾静脉通道。每组10只荷瘤裸鼠于超声辐照/假照前后,行双侧腿部肿瘤的超声造影,记录时长为60s。在超声治疗前,经尾静脉注射阿霉素溶液。同时超声辐照10min,治疗后1h灌注取材,使用高效液相色谱仪测定肿瘤组织内的阿霉素含量。每组另取5只荷瘤裸鼠于治疗前尾静脉注射DiR荧光染料溶液,于治疗后即刻用活体荧光成像系统进行活体荧光成像。每组各取1只荷瘤裸鼠的肿瘤组织行HE染色。3.测量指标:3.1超声造影峰值强度(Peak intensity,PI),曲线下面积(Area under curve,AUC)。3.2高效液相色谱法测量肿瘤组织的阿霉素药物浓度。3.3小动物活体荧光成像系统获得各实验组活体荧光成像图。3.4各实验组胰腺癌组织HE染色结果。结果一、超声联合微泡对胰腺癌细胞凋亡率影响的研究A组(对照组)、B组(单纯微泡组)、H组(高声压联合微泡组)PANC-1细胞的凋亡率分别为3.31%±0.91%、3.08%±1.00%、9.61%±2.92%,与A、B两组相比,H组的凋亡率约为A、B组的3倍,差异有统计学意义(P<0.05)。其余各组间的凋亡率两两比较差异均没有统计学意义(P>0.05)。二、超声诊疗一体机VINNO70超声空化可调参数的测量1.超声诊疗一体机VINNO70在VFLASH超声空化可调模式下的PL、中心频率的实测值均与仪器标定值一致。2.随着仪器设定的MI值由0.09逐渐上调至1.29,其对应的峰值负压实测值也由0.14MPa上升至1.62MPa,呈正相关的关系。3.探头X4-12L的声场在Y轴方向基本符合高斯分布,在X轴的分布:空化治疗聚焦区(ROI)内基本是矩形分布;随着距离窗沿增加,窗外声场减弱,基本呈高斯分布。三、诊断超声联合微泡增敏裸鼠胰腺癌化疗的研究1.A、B、C三组裸鼠胰腺癌移植瘤治疗侧的PI、AUC在超声辐照后较超声辐照前均有增高,差异存在统计学意义(P<0.05);2.A、B、C组治疗侧肿瘤组织阿霉素药物浓度分别为(1.45±0.53)ug/g、1.75(1.60,1.80)ug/g和1.13(0.65,1.33)ug/g,对照侧分别为(1.07±0.46)ug/g、1.76(1.72,1.78)ug/g和1.04(0.71,1.33)ug/g。A组治疗侧药物浓度明显高于对照侧(t=﹣5.163,P<0.05);B组及C组治疗侧与对照侧药物浓度差异均无统计学意义(Z=﹣0.297、﹣0.357,P=0.766、0.721)。3.小动物活体荧光成像的结果显示,A组的5只裸鼠中有2只裸鼠的治疗侧荧光物质DiR的聚集程度高于对照侧。B组及C组治疗侧与对照侧荧光物质DiR的聚集程度无明显差异。4.A、B、C三组治疗侧肿瘤组织与对照侧肿瘤组织HE染色结果显示,各组均无显著组织出血及细胞肿胀。结论1.峰值负压为2184KPa的超声联合微泡辐照胰腺癌细胞,可以显著增加PANC-1细胞的凋亡率,且差异具有统计学意义(P<0.05)。2.本研究动物实验所使用的超声诊疗一体机VINNO70的X4-12L线阵探头标定的调控空化相关的声学参数与实测值基本相符,且声场呈高斯分布。3.MI=0.3的诊断超声联合微泡能够增强裸鼠胰腺癌移植瘤的血流灌注并增加局部化疗药物浓度。