丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)是一种属于Y变形菌门(Gammaproteobacteria)的革兰氏阴性菌,也是一种长期以来被习惯上认为是一类对动物细胞无害的细菌种。目前国内外对于丁香假单胞菌的研究主要集中在其侵染植物活性、方式与致病机理等方面,而对该菌是否具有对模式动物秀丽隐杆线虫的毒性此前并没有研究报道。本实验室从植物冻伤组织分离了一株有高冰核活性(Ice-nucleating activity)的丁香假单胞菌 MB03,其对宿主植物具有较高的冻害和侵染活性。本研究重点进行该菌对模式动物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的病原生物学活性及其部分生物学行为的影响。首先对丁香假单胞菌MB03进行了全基因组测序,并在前后两次测序结果基础上进行了该菌与同属相近菌株的比较基因组学分析。测序和序列拼接结果显示,MB03基因组大小为5.77 Mb,编码5029个基因。通过多重序列比较分析和平均氨基酸同源性矩阵分析发现,MB03与丁香假单胞菌丁香亚种(P.syringae subsp.syringae)B64、SM和HS191这3株菌株之间的亲缘关系更为接近;但在单独与B64、SM和HS191进行基因组一一对比后发现,MB03分别有386、397和377个自身特有的基因。从GenBank数据库中选择序列已公开的总共6株丁香假单胞菌丁香亚种作为参考菌株,发现共有159个基因是MB03所独有的基因,而部分基因是MB03的重要毒性因子编码基因,包括10种Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)的效应蛋白基因、2个Ⅵ型分泌系统(Type Ⅵ secretion system,T6SS)基因簇和1个芒果毒素合成的基因簇。此外,还发现MB03中含有潜在毒性因子的独特的基因岛。为进一步发掘潜在的杀线虫基因,将MB03的基因组与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1和PA14比较,找到了 115个分别与PAO1和PA14中的杀线虫毒性基因具有高度序列相似性的基因,由此构建了 MB03菌株的杀线虫活性基因网络。利用多种不同的生物测定实验进行了对在不同培养基(不同营养条件)中MB03对秀丽隐杆线虫毒性影响的评估,包括杀线虫实验、趋避性实验、取食偏好性实验和L4期生长测定实验等。杀线虫实验结果表明,MB03在特定的条件下可以杀死秀丽隐杆线虫,不同培养基条件下宿主和细菌相互作用产生的结果也不同,在NGM培养基上MB03对秀丽隐杆线虫表现为非致病性,但是在PG培养基上则表现为致病性。利用红色荧光蛋白标记方法来研究MB03在秀丽隐杆线虫肠道定殖的情况,发现只有在PG培养基上,MB03能够在秀丽隐杆线虫肠道内定殖。为了研究在加入秀丽隐杆线虫后,丁香假单胞菌MB03中线虫毒性基因的表达水平变化情况,研究选取了 41个基因进行实时荧光定量聚合酶链式反应分析。结果表明,在PG平板上添加秀丽隐杆线虫后,MB03中的荧光铁载体、phoQ/phoP和鞭毛相关的基因发生了明显上调。除此以外,蛋白酶类相关的一些基因也发了上调,例如pepP、clpA和clpS。另一方面,在NGM平板上添加秀丽隐杆线虫后,MB03中kdpD和kdpD和kdpB下调了 3倍。为了进一步鉴定phoB、phoP、clpA、kdpD和kdpE基因在秀丽隐杆线虫感染模型中的作用,本研究对以上各基因一一进行了基因中断和杀线虫活性对比测定,结果发现突变株△clpA、△kdpD和△kdpE对秀丽隐杆线虫的毒性明显变弱;且突变株△clpA、△kdpD和△kdpE对秀丽隐杆线虫肠道的定殖能力也变弱。另外,突变株△phoB在代谢物分泌上产生了缺陷,对秀丽隐杆线虫表现出欺骗性行为,导致秀丽隐杆线虫不能识别该突变株是否为病原菌。上述研究结果表明,在琼脂平板上进行的对秀丽隐杆线虫的毒杀过程是一个长时间的线虫宿主和病原菌相互作用的结果,其间丁香假单胞菌MB03分泌一些有毒的代谢产物且能被秀丽隐杆线虫感知;丁香假单胞菌MB03对秀丽隐杆线虫的致病性是分泌的代谢产物和肠道定殖的共同作用下的结果。此前人们认为丁香假单胞菌是对动物细胞无伤害的非动物病原菌,但本文提供的研究证据证明MB03对秀丽隐杆线虫是有毒性的,从而改变了丁香假单胞菌对动物模型无害这一传统观点。