论文部分内容阅读
目的随着基础研究的深入,人们认识到血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)成为心血管疾病药物治疗作用的靶细胞之一。局部血管损伤后产生过量的活性氧(reactive oxygen species, ROS),对刺激VSMC增殖起重要作用,故有效阻断ROS对VSMC的增殖与凋亡的作用是防治动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的重要措施之一。因此,以VSMC为细胞模型筛选出有效抑制其生长增殖而毒副作用较低的药物并研究其作用机理,是近年来医学研究的难点和热点之一。丹参的有效成分主要为丹参的水溶性物质,具有抑制血小板粘附、聚集、释放、增加血清cAMP水平,抑制TXA2形成,促进PGI2生成,清除氧自由基,抗脂质过氧化等作用。本课题利用细胞培养技术观察丹参对过氧化氢(H2O2)等活性氧(ROS)诱导的大鼠VSMC增殖、凋亡的影响,为对抗H2O2介导的脂质过氧化损伤的保护作用提供实验依据。方法取180-200g的Wistar大鼠(华中科技大学同济医学院动物实验中心提供)胸主动脉中膜用组织块贴壁法以及酶消化法培养VSMC,在倒置相差显微镜下观察VSMC特征性的“峰”和“谷”状生长,取3-5代培养细胞经抗α-SM肌动蛋白单抗鉴定阳性细胞率达85%以上者用于实验。培养液中加入过氧化氢(H2O2)诱导大鼠VSMC的增殖,通过实验确定促VSMC增殖作用最显著的H2O2浓度为实验浓度。注射用丹参(冻干),通过实验确定最低实验浓度以及最佳作用时间。最后通过建立H2O2刺激主动脉血管平滑肌细胞增殖的体外模型,丹参作为影响平滑肌细胞增殖因素,用MTT、免疫组织化学等方法,来测定并分析平滑肌细胞增殖的情况,并且通过测量bcl-2和bax蛋白表达量来进一步分析平滑肌细胞的增殖与凋亡之间的相关性。实验分组：1)正常对照组：常规培养的VSMC;2) H2O2刺激对照组；3) H2O2+丹参低剂量组组；4)H2O2+丹参中剂量组；5)H2O2+丹参高剂量组组。进行VSMC增殖与凋亡实验,观察分析丹参对活性氧(H2O2)诱导培养的大鼠VSMC增殖周期时相的影响以及凋亡的影响。结果1取Wistar大鼠胸主动脉血管平滑肌经过原代和传代培养成功后,用3-5代处在生长对数期的细胞进行抗α-SM肌动蛋白单抗鉴定,85%以上为阳性,则可以用于实验。2H2O2浓度在0.02-180μM范围内对VSMC具有促进增殖的作用,其中当H2O2浓度为30μM时,其增殖作用最显著；当浓度超过225μM以后,与阴性对照比较,P<0.01,则说明H2O2浓度超过225μM以后,对细胞具有一定的毒性,抑制VSMC的增殖。在时间效应上,持续36小时的刺激后,VSMC的增殖效果最显著；持续刺激6小时后VSMC就开始增殖,随时间的延长增殖作用也增强,36小时达到最强,之后就相对减弱。3丹参浓度为0.4mg/ml时对VSMC有抑制作用,随着浓度的增加抑制作用逐步加强,到达3.2mg/ml以后,抑制作用趋于稳定；丹参持续作用36小时后,对VSMC的抑制率达到51.5%,之后对VSMC的抑制作用趋于稳定状态。4与正常对照组比较,H2O2刺激对照组的bcl-2表达量明显增加(P<0.05),而bax表达却减少,但没有统计学意义；与H2O2刺激对照组比较,丹参中剂量组和丹参高剂量组的bax表达量明显增加(P<0.05),而bcl-2的表达量明显减少(P<0.05),丹参低剂量组的bax表达量增加,bcl-2表达量减少,但都没有统计学意义。结论1.血管平滑肌细胞在体外培养条件下,H2O2能够促进其增殖。2.丹参能够抑制H2O2刺激的血管平滑肌细胞增殖作用,促进血管平滑肌细胞的凋亡。3.丹参抑制血管平滑肌细胞增殖及促进其凋亡作用,其机制可能是,丹参抑制bcl-2基因及表达,促进bax基因及表达,降低Bcl-2/Bax比值,从而使细胞增殖和凋亡达到一种正态的平衡。