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滤过性手术是目前临床上常用的抗青光眼术式，而滤过道瘢痕形成是导致滤过性手术失败的主要原因。青光眼滤过性手术联合使用抗代谢药物，如五氟脲嘧啶(5-FU)、丝裂霉素(mitomycin，MMC)等，可以减少术后滤过道瘢痕形成，提高手术的成功率。但是抗代谢药物的使用，也导致术后低眼压、滤过泡渗漏等并发症增多，因此需要探索更加安全有效的治疗方法。人结膜下Tenon’s囊成纤维细胞(human tenon’s capsule fibroblast，HTF)是存在于结膜下结缔组织内的一种未分化的间叶细胞。手术或损伤后，成纤维细胞(fibroblast，FB)表型转化成肌成纤维细胞(myofibroblast，MF)启动了瘢痕反应。在伤口闭合和上皮化生后，MF持续存在导致肉芽组织的持续形成，是病理性瘢痕形成的重要原因。不同的研究证实：HTF转化为MF，过度合成胶原纤维等细胞外基质成分，是青光眼滤过术后滤过道瘢痕化的关键。转化生长因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)是诱导HTF转化为MF最重要的细胞因子。动物实验中，TGF-β2抗体能够抑制滤过性手术后滤过道的瘢痕形成。TGF-β具有多种功能，如调节增殖、诱导转化、凋亡以及促进细胞外基质的合成等，在配体水平阻断TGF-β可能会削弱其在结膜伤口愈合过程中的有益作用。另外，TGF-β的3种单体具有类似的功能，阻断1种单体并不能完全阻断TGF-β的作用。而不同的TGF-β单体均通过同样信号转导通路介导其生物学功能，因此在信号转导通路水平阻断TGF-β的作用具有更多的优势。活化素受体样激酶5(activin receptor-iike kinase 5，ALK5)是TGF-β信号转导的关键性节点，抑制了ALK5与底物的结合或ALK5对底物的磷酸化作用就可以阻断信号向细胞核的转导。SB-431542是一种强大的ALK5抑制剂，可以选择性的抑制ALK5。本课题主要研究ALK5抑制剂(SB-431542)对兔滤过性手术后滤过道瘢痕化的抑制作用，在细胞水平探索其作用机制及可能的信号转导通路。这方面的实验研究将为抑制青光眼滤过术后滤过道瘢痕化提供理论依据。目的：(1)应用滤过性手术建立兔滤过道瘢痕化动物模型，以此为研究对象，观察ALK5抑制剂--SB431542对滤过术后滤过道瘢痕化的抑制作用。(2)建立HTF表型转化细胞模型，探讨SB431542能否抑制HTF表型转化及胶原合成，为抑制青光眼滤过术后瘢痕形成提供新策略。方法：(1)应用滤过性手术建立兔滤过道瘢痕化动物模型：选用12只健康新西兰白兔作为实验动物，在全身麻醉下行右眼滤过性手术。术后观察并测量眼压(intraocular pressure，10P)。手术后第7、14和21 d三个时间点各处死2只实验兔，术后第28 d处死其余实验兔，摘除实验眼，制作切片，光镜下观察。(2)SB431542对滤过道瘢痕化的抑制：对24只健康的新西兰白兔施行右眼滤过性手术。随机分为4组，每组6只兔(6只眼，n=6)。A组(对照组)：滤过性手术完成时及术后第1、2、3和7 d，分别于实验眼球结膜下注射100μl含10％DMSO的PBS(SB431542溶剂)；B、C和D组为用药组，B组(阳性对照组，MMC组)：滤过性手术中巩膜瓣下按常规方法使用0.2mg／ml的丝裂霉素(MMC)；C组(SB0.5组)滤过性手术完成时及术后第1、2、3和7 d，分别于实验眼球结膜下注射100μl浓度为0.5mM的SB431542；D组(SB2.0组)：滤过性手术完成时及术后第1、2、3和7 d，分别于实验眼球结膜下注射100μl浓度为2mM的SB431542。术后观察并测量眼压。术后第28 d处死实验兔，摘除实验眼，制作切片，光镜下观察。(3)建立TGF-β诱导HTF表型转化的细胞模型：组织贴块法培养HTF，以10μg／L TGF—β1诱导HTF。检测α-平滑肌肌动蛋白(alpha Smooth muscle actin，α-SM-actin)，结缔组织生长因子(connectivetissue growth factor，CTGF)、Ⅰ型胶原纤维(typeⅠcollagen，ColⅠ)及磷酸化Smad2、ERK、P38和AKT的表达。(4)SB431542对细胞表型转化的影响：1～20μM的SB431542预处理30min，10μg／L TGF-β1诱导HTF表型转化，检测α-SM-actin、CTGF、ColⅠ以及磷酸化的Smad2、ERK、P38和AKT表达的改变。结果：(1)兔滤过道瘢痕化动物模型：术前实验眼基础眼压为13.83±1.80 mmHg，术后第2d，眼压下降(IOP=3.33±1.55 mmHg，P＜0.05)；术后第14d仍眼压较术前降低(IOP=10.6±2.22 mmHg，P＜0.05)；到术后第17d，眼压恢复到手术前水平(IOP=12.62±2.13 mmHg，P＞0.05)。组织学观察显示：术后第7d，滤过道周围及结膜瓣下可见大量炎症细胞浸润伴成纤维细胞增生；术后第14d，可见成纤维细胞增生伴少量胶原纤维形成；第21d，滤过道周围组织中成纤维细胞数量减少，代之以瘢痕组织；第28d时滤过道周围组织中细胞成分减少，主要为胶原纤维沉积，呈现瘢痕样改变。(2)SB431542对滤过道瘢痕化的抑制：术前4个实验组的眼压无差异(P＞0.05)，术后第7d，4个实验组眼压均较术前显著下降(P＜0.01)。术后第14d对照组的眼压低于术前(IOP=9.67±2.42 mmHg，P＜0.05)，之后眼压逐渐恢复到术前。在术后第25d，MMC组、SB0.5组和SB2.0组的眼压分别为10.83±1.60 mmHg，8.0±0.89 mmHg和10.83±2.14 mmHg，均低于术前水平(P＜0.05)。术后第14、21、25d，和对照组相比，MMC组和SB组有更低的眼压(P＜0.05)，而在术后第25d，SB0.5组和MMC组相比，能维持更低的眼压(P＜0.05)。组织病理学检查结果显示：术后第28d，SB组的实验眼滤过道周围MF和瘢痕组织均较对照组的明显减少。(3)TGF-β诱导HTF表型转化的细胞模型：TGF-β1诱导HTF后，α-SM-actin的表达在转录水平及蛋白水平均上调，峰值分别为24h和48h，提示HTF已分化为MF；同时发现CTGF的表达在转录水平及蛋白水平亦上调，且峰值在α-SM-actin表达之前，分别为12h和24h；更重要的是TGF-β1可诱导HTF内ColⅠ表达上调。进一步研究其信号通路机制发现，TGF-β1诱导HTF后，细胞内Smad2、ERK、P38和AKT的磷酸化蛋白均有表达。(4)SB431542对细胞表型转化的抑制：ALK5抑制剂SB431542(1～20μm)预处理HTF 30 min，再以10μg／LTGF-β1诱导HTF，发现SB431542能抑制TGF-β1诱导的CTGF、α-SM-actin和ColⅠ的上调；且SB431542可有效抑制TGF-β1诱导的p-Smad2表达，但对TGF-β1诱导的MAPK通路没有影响。结论：球结膜下注射SB431542，可抑制兔滤过性术后滤过道瘢痕的形成；其细胞学机制可能为：SB431542通过干预TGF-β1诱导的Smad信号通路抑制HTF细胞表型转化(α-SM-actin，CTGF表达下调)，减少胶原合成。