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小鼠是研究哺乳动物内耳形态形成及细胞分化发育、遗传性内耳疾病的极佳动物。前庭是内耳的重要组成部分，其起源与耳蜗相同，发育早于耳蜗，出生时前庭发育基本完成。哺乳动物前庭感觉器官的发育过程中，有多达几十种基因的参与，它们在时间、空间上精细、准确地差异表达，并以此决定各感觉器官、感觉上皮的分化发育方向。TGF-β超家族成员BMP4及其下游调节基因Smad4对于内耳发育的作用可能比较关键，但BMP4/Smad4，尤其是Smad4在小鼠内耳前庭发育中究竟有何作用、多大作用，目前不清楚。基因敲除技术是研究基因功能的常用方法。敲基因动物实验发现，Smad4基因剔除纯合子小鼠在胚胎发育早期死亡，杂合子小鼠听力明显障碍，内耳畸形，但其不能完全反映Smad4的作用。因此，本课题组利用基于loxP—Cre系统的条件基因敲除技术，构建了软骨组织Smad4条件基因敲除小鼠动物模型。该动物模型可以在一定程度上反映Smad4在前庭发育中的作用。我们研究了该动物模型的前庭功能及前庭末梢器官病理形态改变，同时，对C57BL/6小鼠的前庭发育过程及该过程中BMP4/Smad4在内耳前庭分布的时空特征进行了初步研究，并结合实验结果，对Smad4可能影响前庭发育的机制进行了探讨。第一部分：Smad4条件基因敲出小鼠的前庭功能检测通过设计的一系列前庭功能检测实验对同窝成组的软骨组织Smad4条件基因敲除野生型、杂合子、纯合子小鼠的前庭功能进行了对比性评估。这些前庭功能检测方法包括：一般行为观察、空间姿势反射、游泳试验、前庭眼反射(VOR)、短声刺激前庭诱发肌源性电位(VEMP)等。结果没有发现软骨组织Smad4条件基因敲除小鼠出现行为、步态、空间姿势反射和游泳实验等前庭综合功能障碍；三个基因型小鼠均能诱出眼震且相互之间没有差别；VEMP的潜伏期在三个基因型组间无差异，与野生型和杂合子相比，纯合子小鼠VEMP的反应阈值明显增加。该研究显示，前庭功能系列检测结果一致，只有Smad4条件基因敲除纯合子小鼠的部分球囊功能受到一定程度的影响。第二部分：Smad4条件基因敲除小鼠前庭外周器官的病理形态变化该部分通过冰冻切片、半薄切片、超薄切片；甲苯胺蓝染色、HE染色；大体观察、普通光镜、激光扫描共聚焦显微镜、扫描电镜、透射电镜观察；Southern Blot、免疫荧光、免疫组织化学等技术方法对软骨组织Smad4条件基因敲除野生型、杂合子、纯合子小鼠的内耳前庭结构、病理变化情况进行了研究。结果发现：1．Southern Blot及免疫组化显示小鼠内耳前庭软骨囊里Smad4被有效剔除，而前庭感觉上皮里Smad4表达没有受到明显影响。2．纯合子小鼠体形、内耳颞骨体积明显小于野生型和杂合子，纯合子小鼠内耳前庭形态轮廓基本正常，局部畸形，半规管及半规管壶腹嵴、椭圆囊及斑、球囊及斑、内淋巴管和内淋巴囊均小于野生型和杂合子小鼠，其半规管走行与野生型和杂合子小鼠不同，但无明显畸形。3．纯合子小鼠后半规管壶腹嵴的副嵴明显粗大，副嵴与后半规管壶腹嵴间的距离变小；纯合子小鼠后半规管壶腹嵴偶可见到感觉上皮有空泡样变；三个基因型小鼠未见其它病理改变。扫描电镜和透射电镜在三个基因型小鼠的前庭均未发现病变。神经丝免疫荧光染色提示Smad4条件基因剔除小鼠前庭上皮里的初级前庭神经元末梢分布正常，其与毛细胞的联系正常。该研究提示，软骨组织Smad4条件基因敲除小鼠动物模型造模成功；Smad4条件基因敲除小鼠的内耳前庭形态轮廓基本正常但细节上有一定程度的畸形，纯合子小鼠前庭末梢感受器病理改变轻微。第三部分：C57BL/6小鼠前庭末梢器官的形态发育及BMP4、Smad4在其各个阶段的表达该部分通过冰冻连续切片、HE染色及免疫组织化学染色后普通光镜观察、免疫荧光染色后激光扫描共聚焦显微镜观察等技术方法对C57BL/6小鼠内耳前庭的发育过程及发育过程中BMP4、Smad4的表达情况进行了研究。结果发现：1．小鼠前庭的发育较早、过程较短，E15时所有囊斑、壶腹嵴基本形成，所有壶腹嵴、囊斑里均出现MyosinⅥ阳性表达毛细胞，未见支持细胞表达MyosinⅥ。2。BMP4从E10开始，在间充质浓聚前就有表达；间充质一开始浓聚，BMP4在其中就有较丰富的表达；早期主要表达在前庭囊及前庭囊周围的间充质，在胚胎发育的后期，其在软骨囊及前庭上皮里有广泛阳性表达。3．Smad4在小鼠内耳前庭的表达情况与BMP4不一致，E10到E12的小鼠内耳Smad4表达阴性，E15时各个壶腹嵴、囊斑里才有较明显的Smad4表达，而内耳周围软骨囊到E16时才有明显的Smad4表达。该研究结果提示，E15是前庭毛细胞成熟的关键时期；BMP4与小鼠内耳前庭形态形成及毛细胞分化发育、功能形成有关；Smad4与BMP4的表达时空特征不同，Smad4在小鼠内耳前庭发育的早期作用并不关键，BMP4的信号转导可能还存在其它途径。通过上述研究，我们认为Smad4在小鼠内耳前庭发育的早期作用并不关键，但Smad4参与了发育后期的形态塑形和功能发育。