真菌次级代谢产物是天然产物的主要来源之一，在新药和新药先导化合物的发现研究中占有非常重要的位置。虽然真菌资源在自然界中十分丰富，但是受限于筛选模型的局限性，大部分的真菌在高通量筛选下并不显示特定的活性。这些无活性菌株通常被闲置，造成资源的浪费。如何调控改造无活性真菌的代谢功能，使之拥有产生活性化合物的能力是具有重要意义的科研课题。随着真菌基因组研究的不断深入，真菌中大量的未表达基因被发现，其中蕴含的沉默的代谢能力为活性化合物的发现提供了可能。基于此，本课题组前期开展了一系列针对无活性放线菌和真菌的代谢功能改造研究，通过人工诱变、抗生素抗性筛选等手段获取了多批活性突变株，并且完成了部分活性突变株中新产活性化合物的分离鉴定工作，阐明了活性的来源。　　基于前期利用抗生素抗性筛选技术进行真菌改造的研究积累，本研究首先对反复继代多次的原始菌G59及其5株新霉素抗性突变株进行了复壮及液体发酵培养，并采用MTT法体外细胞实验测试所选菌株发酵物对于人慢性粒细胞白血病K562细胞的抑制活性，通过与初次筛选时发酵物活性测试结果进行对比，其中3株突变株的发酵物测试数据与前次结果接近，仍然具有较好活性；另外2株的发酵物活性明显减弱，代谢功能发生了退化。结合与原始菌 G59发酵物的HPLC-PDAD-UV指纹图谱对比分析结果，最终选定了一株活性较强、遗传稳定并且代谢产物与原始菌G59差异较大的突变株3-f-31进行后续的新产活性代谢产物研究。　　通过测定一段连续时间内发酵物浸膏质量和肿瘤细胞抑制活性随时间变化的规律构建了该菌株发酵的时效曲线，确定了在指定发酵条件下该菌株的最佳发酵时间为10天，此时发酵物的乙酸乙酯浸膏质量达到顶峰且活性处于相对高值。以此为指导进行了小规模发酵，初步探索其浸膏中的新产活性代谢产物。利用多种柱层析以及HPLC等分离手段，采用活性追踪与新产化合物追踪相结合的方式，分离并鉴定了7个已知化合物：fructigenine A(1)，rugulosuvine A(2)，fructigenine B(3)，penicimutanin(4)，penicimutatin(5)，cyclo(L-Trp-L-Phe)(6)和aspterric acid methyl ester(7)。化合物分离过程中发现浸膏内存在部分结构新颖的化合物因含量较少难以进行结构解析，重复相同的过程进行放大规模发酵。产物分离阶段沿用前次新产物与活性产物兼顾的分离策略进行分离，共获得了15个化合物。通过结构解析其中6个化合物（8-13）为新化合物，另外9个鉴定为已知化合物cyclo(L-Val-L-Pro)(14)， cyclo(L-Ile-L-Pro)(15)， cyclo(L-Leu-L-Pro)(16)， cyclo(L-Phe-L-Pro)(17)，o-toluidine(18)，penipratynolene(19)，cerebroside A(20)，cerebroside B(21)和monolinoelaidin(22)。　　新化合物8和9是一对具有[4,5]氧杂螺环结构的差向异构体，该类骨架化合物至今只有4个被报道。并且由于五元环的半缩醛结构不稳定导致羟基存在构型变化，化合物8和9在溶液状态下分别以一对处于动态平衡的差向异构体的状态存在（NMR谱图中给出两套数据）。分别测试了化合物8和9在CDCl3、CD3OD、acetone-d6和pyridine-d5四种不同溶剂中的1H和13C NMR，根据1H NMR中独立H信号的积分比值确定了不同溶剂中互变异构体的比例。新化合物10是化合物8和9的前体十四碳支链酰胺，新化合物11是2-OH甲氧基化的化合物8。新化合物12和已知化合物4是penicimutanin类化合物，该类化合物由二酮哌嗪部分与螺环类化合物8组合而成。此类化合物最初发现自一株产紫青霉G59的DES诱变株BD-1-3中，经鉴定为原始菌G59不生产而突变株生产的新产代谢产物。本次在抗生素抗性筛选株中再次被发现，表明两种真菌改造手段激活了相同或相似的沉默生合成相关基因。新化合物penicimutide(13)为环二肽类化合物，由脯氨酸残基和一个不常见的4,5-脱氢亮氨酸（4,5-didehydro-L-Leu）残基组成。4,5-脱氢亮氨酸通常被认为是人工氨基酸，是首次在天然产物中发现。　　通过HPLC-PDAD-UV和HPLC-ESI-MS技术对原始菌G59和突变株3-f-31的乙酸乙酯浸膏进行对比，使用分离获得的化合物作为对照进行新产验证分析。结果显示在UV/MS检测水平下，化合物1-6,8-15,18-21只能在突变株中检测到，而在原始菌中检测不到；化合物16和17的离子峰信号在两个浸膏中都能被检测到，但是突变株中的信号强度显著提高。实验证明化合物1-6,8-15,18-21为突变株新产而原始菌不产的化合物，化合物16和17为突变株增产的代谢产物。这些化合物根据结构分析主要来自聚酮合成途径（PKS）以及非核糖体肽合成途径（NRPS），表明原始菌G59中多种沉默的代谢途径在其新霉素抗性突变株3-f-31中被激活。　　采用MTT法测试了全部22个化合物的对5株肿瘤细胞（人慢性粒细胞白血病细胞K562，人急性早幼粒白血病细胞HL-60，人宫颈癌细胞HeLa，人胃腺癌细胞BGC-823，人乳腺癌细胞MCF-7）的体外抗肿瘤活性，其中化合物1,2,4,8-12和22在100μg/mL浓度下对所测肿瘤细胞的24 h抑制率（IR％）大于50%。新化合物8和9对HL-60细胞的24 h IC50值分别达到3.8和7.4μM，具有进一步修饰开发的潜力。　　本研究结果表明，DMSO介导的新霉素抗性筛选技术可以改变产紫青霉G59的代谢过程，使其次级代谢产物的种类更加丰富，生产出结构新颖且具有一定抗肿瘤活性的化合物。此方法在传统核糖体工程研究方法上加以创新，将原本用于原核生物核糖体代谢功能改造的氨基糖苷类抗生素通过物理化学方法拓展到真菌代谢功能改造上，且整体实验具有设备要求低、操作简便、周期短等优点，未来可广泛推广到其它无活性真菌的代谢功能改造研究中，在拓展真菌菌株资源以及探索潜在药物分子方面具有重要的应用前景。