苯是环境中普遍存在的确定人类致癌物。长期吸入能引起机体多器官毒性及贫血、MDS和血液系统恶性肿瘤如白血病等不同的疾病。苯的毒性作用主要来自于体内形成的代谢产物，其中1，4-苯醌是确定的致白血病物质。本课题围绕苯造血毒性与恶性转化作用机制开展动物实验与细胞研究。首先建立了苯对小鼠的亚慢性染毒模型，研究苯对小鼠的亚慢性毒性作用、对造血系统的毒性损伤作用，以及苯致骨髓细胞中Wnt、Notch、Hh等信号通路变化与造血毒性的关系，以探讨苯致造血系统毒性的机制。课题的第二部分则在检测苯及1，4-苯醌对人胚肺成纤维细胞(HELF)毒性作用的基础上，研究1，4-苯醌对HELF细胞的凋亡效应与机制，以及恶性转化作用与可能的分子机制。　　一、亚慢性苯暴露对小鼠造血毒性及其信号转导机制研究　　本研究以玉米油溶剂、低剂量(300 mg/kg)、高剂量(600 mg/kg)苯皮下注射分别染毒C3H小鼠，5次/周，持续3个月，染毒结束后继续观察3个月。通过一般情况观察、血常规、体重及脏器系数、组织病理学检查等研究苯对C3H小鼠的亚慢性毒性。结果表明，苯染毒初期，对小鼠神经系统具有兴奋效应，随染毒时间延长，逐渐转为神经抑制；苯亚慢性染毒影响小鼠正常生长，降低外周血中红细胞和白细胞数目，使小鼠发生贫血，抑制骨髓和脾脏造血，并且对小鼠肝脏、脾脏、肺、骨髓造成不同程度的损害作用。　　苯亚慢性染毒对小鼠造血系统的毒性则通过血常规、骨髓象检查(骨髓涂片)、骨髓切片病理学检查、骨髓中造血干细胞比例、造血集落形成实验进行观察。结果表明，苯亚慢性染毒能影响外周血血象，抑制骨髓重建红系及粒-巨噬细胞系造血能力，降低LKS干细胞在未分化成熟骨髓细胞(Lin-)中的比例，对骨髓造血干细胞的造血功能表现出一定程度的抑制。　　通过荧光定量PCR检测骨髓单个核细胞中Wnt信号通路β-catenin、c-Myc基因，Notch信号通路Notchl、CyclinDl基因，Hh信号通路的Bmil、P53基因的表达情况来探讨三条信号通路与苯造血毒性的关系。结果显示，Wnt信号通路中的c-Myc在高剂量组中表达显著升高；染毒组Notchl通路和Hh通路中的下游基因CyclinDl、P53基因较对照组表达量增加，但没有显著性差异。以上结果显示，苯亚慢性染毒小鼠可能导致Wnt通路基因的改变，c-Myc基因的高表达是可能是造血异常的机制之一。由于以上信号通路是造血干细胞更新与分化的关键信号通路，因此提示我们在骨髓单个核细胞的研究基础上应进一步探讨上述信号通路在造血干细胞中的变化。　　二、苯及1，4-苯醌对HELF细胞的毒性作用与机制研究　　以MTT实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验来研究苯及1，4-苯醌对HELF细胞的毒性作用。结果表明，苯和1，4-苯醌可以抑制HELF细胞生长，影响细胞周期分布并诱导细胞凋亡。在此基础上，进一步通过彗星实验、微核试验来观察1，4-苯醌对HELF细胞的致遗传毒性，并用RT-PCR法检测凋亡相关基因的mRNA表达水平以探讨其凋亡机制。彗星及微核实验结果显示，以0、10、20、40、80μmol/L，的1，4-苯醌对HELF细胞进行染毒，1，4-苯醌对HELF细胞具有明显的遗传毒性，并可致Bax、Bcl-2、P53基因表达水平上调。以40μmol/L1，4-苯醌染毒24、48、72h后，Bax、P53的相对表达水平随着时间延长而上升，Bcl-2的相对表达水平随着时间延长而下降，Bax/Bcl-2值随着时间延长而增加。1，4-苯醌染毒使细胞P53，Bax/Bcl-2值增加，可能是诱导细胞凋亡的机制。　　以30μmol/L，1，4-苯醌染毒5次后的细胞进行连续传代以进行恶性转化。通过连续传代，细胞逐渐出现形态不规整，生长紊乱，体积变大，生长速度变缓等。而第1、5、10、15代时软琼脂集落实验和ConA凝集实验都显示阴性结果，表明此时HELF细胞尚未发生恶性转化。P53和c-Myc两个基因在第1～5代时都呈现表达上升趋势，但在第5～15代期间，表达量则随传代次数增加表现为缓慢下降，可能原因是在1～5代期间，1，4-苯醌对细胞产生了严重的DNA损伤，细胞P53、c-Myc表达应激性上升，而随着传代次数的逐渐增加，DNA损伤逐渐被修复，两个基因的表达量随之逐渐下降。结合染毒组的形态学观察和P53、c-Myc的持续高表达，提示1，4-苯醌可能诱导HELF细胞恶变。