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目的:构建人乳头瘤病毒18型(HPV18)E2基因真核表达载体pcDNA3.1(+)/E2,将其与IL-12真核表达载体pcDNA3.1(+)/IL-12联合免疫BALB/c小鼠,检测小鼠产生的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,为HPV18诱发的宫颈癌治疗性核酸疫苗的研制奠定实验基础。方法:(1)用PRIMER5.0软件设计HPV18 E2基因引物,PCR扩增E2基因,将其插入pGEX-6P-2载体,构建重组载体pGEX-6P-2/E2,并进行序列分析。将重组质粒pGEX-6P-2/E2转化表达宿主菌E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,纯化目的蛋白,并分析其抗原性。(2)将E2基因克隆至真核细胞表达载体pcDNA3.1(+),构建E2真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)/E2,并进行序列分析。将质粒pcDNA3.1(+)/E2转染HeLa细胞,Western blot鉴定E2蛋白在HeLa细胞中的表达。(3)将35只6w龄BALB/c小鼠随机分为5组,即pcDNA3.1(+)/E2+pcDNA 3.1 (+)/IL-12组、pcDNA3.1(+)/E2组、pcDNA3.1(+)/IL-12组、空质粒pcDNA3.1(+)组及PBS组。将200μg质粒肌肉注射小鼠,隔2周注射1次,共注射4次。首次免疫当天及其后第2、4、6周剪尾取血,第8周摘眼球放血处死小鼠,分离血清,-20℃保存待测;无菌取小鼠脾脏,制备脾细胞悬液。(4) ELISA间接法测定小鼠血清中E2 IgG抗体水平,ELISA双抗体夹心法检测脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-4水平,MTT比色法检测脾细胞增殖反应,免疫荧光组化法检测E2蛋白在小鼠肌肉组织中的表达。结果:(1)构建的pGEX-6P-2/E2原核表达载体经SDS-PAGE分析,能在E.coli中由IPTG诱导表达一相对分子量约为68 kD GST-E2融合蛋白。(2)构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)/E2能在HeLa细胞内表达一相对分子量约为42 kD E2蛋白;且在小鼠肌肉组织中也能有效表达。(3)小鼠接种pcDNA3.1(+)/E2+pcDNA3.1(+)/IL-12核酸疫苗后能产生特异性IgG,8w后ELISA测定血清抗体A450值为0.859,效价为1:2048。(4)核酸疫苗pcDNA3.1(+)/E2+pcDNA3.1(+)/IL-12免疫组小鼠脾细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ、IL-4含量明显升高(分别为400.60±26.23pg/mL,767.15±37.96 pg/mL),与空质粒组(分别为20.88±1.93 pg/mL、37.32±3.63pg/mL)及pcDNA3.1(+)/IL-12组(分别为44.84±5.99 pg/mL、176.99±24.34 pg/mL)之间差异具有显著性(P<0.01) ,与pcDNA3.1(+)/E2免疫组(分别为226.83±12.55pg/mL、377.44±41.88pg/mL)之间的差异也具有显著性(P<0.01)。(5)pcDNA3.1(+)/E2+pcDNA3.1(+)/IL-12组和pcDNA3.1(+)/E2核酸疫苗组小鼠脾细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数(分别为2.33±0.05和2.04±0.05)明显高于空质粒组(1.31±0.05)、PBS组(1.16±0.04)及pcDNA3.1(+)/IL-12组( 1.39±0.03)(P<0.01)。结论:(1)成功构建的原核表达载体pGEX-6P-2/E2能在原核细胞内表达具有良好抗原性的GST-E2融合蛋白。(2)成功构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)/E2能在真核细胞中表达HPV18 E2蛋白。(3) pcDNA3.1(+)/E2+pcDNA3.1(+)/IL-12联合核酸疫苗和pcDNA3.1 (+)/E2单核酸疫苗均能刺激机体产生较强细胞免疫应答和体液免疫应答。联合核酸疫苗诱生特异性抗体的滴度明显高于E2单核酸疫苗;且联合基因可能诱导更强及更持久的细胞免疫应答。